ਇਮਯੂਨੋਮੋਡੂਲੇਟਰੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਟਿਊਮਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਇਨਵਾਇਰਮੈਂਟ (TME) ਦੀ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹਨ, ਪਰ ਕੁਝ ਅਪਵਾਦਾਂ ਦੇ ਨਾਲ, ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਅਣਜਾਣ ਰਹਿੰਦੀ ਹੈ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ TME ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟਾਂ ਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲੌਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਉੱਚ-ਦਰਜੇ ਦੇ ਸੀਰਸ ਕਾਰਸੀਨੋਮਾ (HGSC) ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਤੋਂ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਅੰਤਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਐਸਾਈਟਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਟਿਊਮਰ-ਘੁਸਪੈਠ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਟੀ ਸੈੱਲ 1-ਮਿਥਾਈਲਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ (MNA) ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਦਾ ਪੱਧਰ ਉੱਚਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ N-ਮਿਥਾਈਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼ (ਇੱਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਜੋ S-adenosylmethionine ਤੋਂ ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਵਿੱਚ ਮਿਥਾਈਲ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ) ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ। ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ, MNA ਟਿਊਮਰ-ਪ੍ਰਮੋਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸਾਇਟੋਕਾਈਨ ਟਿਊਮਰ ਨੈਕਰੋਸਿਸ ਫੈਕਟਰ ਅਲਫ਼ਾ ਨੂੰ ਛੁਪਾਉਣ ਲਈ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, TME-ਪ੍ਰਾਪਤ MNA ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਇਮਿਊਨ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਇਮਯੂਨੋਥੈਰੇਪੀ ਟੀਚੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਟਿਊਮਰ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਟਿਊਮਰ-ਰੋਕੂ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਕ ਸ਼ਕਤੀ 'ਤੇ ਡੂੰਘਾ ਰੋਕੂ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਬੂਤ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਉਹ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਲਈ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਪ੍ਰੇਰਕ ਸ਼ਕਤੀ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ (1)। ਵਾਰਬਰਗ ਪ੍ਰਭਾਵ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੰਮ ਨੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਾਚਕ ਸਥਿਤੀ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਐਨਵਾਇਰਮੈਂਟ (TME) ਦੀ ਇਮਿਊਨ ਸਥਿਤੀ ਨਾਲ ਇਸਦੇ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਹੈ। ਮਾਊਸ ਮਾਡਲਾਂ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ (2), ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ (3) ਅਤੇ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ (4) ਵੱਖ-ਵੱਖ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲ ਉਪ ਸਮੂਹਾਂ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕਈ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਐਂਟੀ-ਟਿਊਮਰ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ ਹੈ ਕਿ ਕੋਐਨਜ਼ਾਈਮ ਟੈਟਰਾਹਾਈਡ੍ਰੋਬਾਇਓਪਟੇਰਿਨ (BH4) ਦੀ ਨਾਕਾਬੰਦੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਨੁਕਸਾਨ ਪਹੁੰਚਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ BH4 ਦਾ ਵਾਧਾ CD4 ਅਤੇ CD8 ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੀ ਐਂਟੀ-ਟਿਊਮਰ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, BH4 (5) ਦੇ ਪ੍ਰਸ਼ਾਸਨ ਦੁਆਰਾ ਕਾਇਨੂਰੇਨਾਈਨ ਦੇ ਇਮਯੂਨੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਬਚਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਆਈਸੋਸਾਈਟਰੇਟ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਸ (IDH) ਮਿਊਟੈਂਟ ਗਲੀਓਬਲਾਸਟੋਮਾ ਵਿੱਚ, ਐਨੈਂਟੀਓਮੇਟਾਬੋਲਿਕ (R)-2-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਗਲੂਟਰੇਟ (R-2-HG) ਦਾ સ્ત્રાવ ਟੀ ਸੈੱਲ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ, ਪ੍ਰਸਾਰ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਲਾਈਸਿਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ (6)। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਮਿਥਾਈਲਗਲਾਈਓਕਸਲ, ਗਲਾਈਕੋਲਾਈਸਿਸ ਦਾ ਇੱਕ ਉਪ-ਉਤਪਾਦ, ਮਾਈਲੋਇਡ ਮੂਲ ਦੇ ਸਪ੍ਰੈਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਮਿਥਾਈਲਗਲਾਈਓਕਸਲ ਦਾ ਟੀ ਸੈੱਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਟੀ ਸੈੱਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਲਾਜ ਵਿੱਚ, ਮਿਥਾਈਲਗਲਾਈਓਕਸਲ ਦਾ ਨਿਰਪੱਖਕਰਨ ਮਾਈਲੋਇਡ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਸਪ੍ਰੈਸਰ ਸੈੱਲਾਂ (MDSC) ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਾਊਸ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਚੈਕਪੁਆਇੰਟ ਬਲਾਕੇਡ ਥੈਰੇਪੀ ਨੂੰ ਸਹਿਯੋਗੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ (7)। ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਯਮਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ TME-ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।
ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ (8) ਵਿੱਚ ਟੀ ਸੈੱਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਇਹ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਾਈਪੌਕਸਿਆ ਅਤੇ ਅਸਧਾਰਨ ਟਿਊਮਰ ਵੈਸਕੁਲੇਚਰ (9) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਪਾਚਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਅਤੇ ਟ੍ਰਿਪਟੋਫੈਨ ਨੂੰ ਲੈਕਟਿਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਕਾਈਨੂਰੀਨਾਈਨ ਵਰਗੇ ਉਪ-ਉਤਪਾਦਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਐਕਸਟਰਾਸੈਲਿਊਲਰ ਲੈਕਟੇਟ ਇੰਟਰਫੇਰੋਨ-γ (IFN-γ) ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਾਈਲੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ ਉਪ-ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨੂੰ ਚਲਾਉਂਦਾ ਹੈ (10, 11)। ਟ੍ਰਿਪਟੋਫੈਨ ਦੀ ਖਪਤ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਰੀਸੈਪਟਰ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ (12-14)। ਇਹਨਾਂ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਮੀਡੀਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਟੀ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਇਮਿਊਨ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰਾ ਕੰਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਾਂ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਸਮਰੂਪ ਮਾਊਸ ਮਾਡਲਾਂ ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਸੀ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੋਈ ਵੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰਾਂ ਅਤੇ ਸਰੀਰਕ ਮੈਕਰੋ ਅਤੇ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਨਹੀਂ ਹੈ।
ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਇੱਕ ਆਮ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਪੈਰੀਟੋਨੀਅਲ ਫੈਲਾਅ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਦੀ ਦਿੱਖ ਹੈ। ਐਸਾਈਟਸ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਤਰਲ ਦਾ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣਾ ਉੱਨਤ ਬਿਮਾਰੀ ਅਤੇ ਮਾੜੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ (15)। ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਇਹ ਵਿਲੱਖਣ ਡੱਬਾ ਹਾਈਪੌਕਸਿਕ ਹੈ, ਇਸ ਵਿੱਚ ਵੈਸਕੁਲਰ ਐਂਡੋਥੈਲੀਅਲ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ (VEGF) ਅਤੇ ਇੰਡੋਲੇਮਾਈਨ 2,3-ਡਾਈਆਕਸੀਜਨੇਜ (IDO) ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਹਨ, ਅਤੇ ਟੀ ​​ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਮਾਈਲੋਇਡ ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਸੈੱਲਾਂ (15-18) ਦੁਆਰਾ ਘੁਸਪੈਠ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਐਸਾਈਟਸ ਦਾ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਾਤਾਵਰਣ ਟਿਊਮਰ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਪੈਰੀਟੋਨੀਅਲ ਸਪੇਸ ਵਿੱਚ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਰੀਪ੍ਰੋਗਰਾਮਿੰਗ ਅਸਪਸ਼ਟ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਟਿਊਮਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਵਿਚਕਾਰ ਮੁੱਖ ਅੰਤਰ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਘੁਸਪੈਠ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ 'ਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਖੋਜ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਇਹਨਾਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ (CD4 + ਅਤੇ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਸਮੇਤ) ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਟਿਊਮਰਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਸੈੱਲ ਵਿਭਾਜਨ ਅਤੇ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਟੈਂਡਮ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (LC-MS/MS) ਵਿਧੀ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਹੈ। ਇਸਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਫੈਲਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਮੁੱਖ ਆਬਾਦੀਆਂ ਦੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸੁਲਝਿਆ ਹੋਇਆ ਪੋਰਟਰੇਟ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਉੱਚ-ਅਯਾਮੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਈਟੋਮੈਟਰੀ ਅਤੇ ਸਿੰਗਲ-ਸੈੱਲ RNA ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ (scRNA-seq) ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੇ ਟਿਊਮਰ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ 1-ਮਿਥਾਈਲਨੀਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ (MNA) ਦੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ T ਸੈੱਲ ਫੰਕਸ਼ਨ 'ਤੇ MNA ਦਾ ਇਮਯੂਨੋਮੋਡਿਊਲੇਟਰੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਹਿਲਾਂ ਅਣਜਾਣ ਸੀ। ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਵਿਧੀ ਟਿਊਮਰਾਂ ਅਤੇ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਆਪਸੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਮਿਊਨ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਵਿੱਚ ਵਿਲੱਖਣ ਸੂਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ T ਸੈੱਲ-ਅਧਾਰਤ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਇਮਯੂਨੋਥੈਰੇਪੀ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਉਪਯੋਗੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਲਾਜ ਦੇ ਮੌਕਿਆਂ।
ਅਸੀਂ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਉੱਚ-ਆਯਾਮੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ਆਮ ਮਾਰਕਰ ਹਨ ਜੋ ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਵੱਖਰਾ ਕਰਦੇ ਹਨ (ਟੇਬਲ S2 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S1A)। ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਦਾ ਪੱਧਰ ਉੱਚਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਅੰਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਤਿੰਨ ਤੋਂ ਚਾਰ ਗੁਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ 1.2 ਗੁਣਾ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਟਿਊਮਰ ਘੁਸਪੈਠ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਲਿਮਫੋਸਾਈਟਸ (TIL) ਦੀਆਂ ਇੱਕੋ TME (ਚਿੱਤਰ 1A) ਵਿੱਚ ਵੀ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਾਚਕ ਜ਼ਰੂਰਤਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ। ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਅਤੇ ਦੋਵਾਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1B)। ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਪਾਚਕ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਾਚਕ ਗਤੀਵਿਧੀ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਅਤੇ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਾਚਕ ਗਤੀਵਿਧੀ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਹੈ। ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਟਿਊਮਰਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ CD4 + ਅਤੇ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਾਚਕ ਸਥਿਤੀ ਜਾਂ ਜਲਣ ਵਿੱਚ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਇਕਸਾਰ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1C)। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, CD45-ਸੈੱਲ ਅੰਸ਼ ਵਿੱਚ, ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ EpCAM+ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਜਲਣ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਵਧਿਆ (ਚਿੱਤਰ 1D)। ਅਸੀਂ EpCAM+ ਅਤੇ EpCAM- ਸੈੱਲ ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਪਸ਼ਟ ਪਾਚਕ ਅੰਤਰ ਵੀ ਦੇਖਿਆ। EpCAM+ (ਟਿਊਮਰ) ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ EpCAM- ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ TME (ਚਿੱਤਰ 1, E ਅਤੇ F) ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਾਂ ਦੀ ਪਾਚਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ।
(A ਅਤੇ B) ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਦੀ ਮੱਧਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ (MFI) (2-NBDG) (A) ਅਤੇ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ (MitoTracker ਗੂੜ੍ਹਾ ਲਾਲ) (B) ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਗ੍ਰਾਫ਼ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਸਾਰਣੀਬੱਧ ਡੇਟਾ (ਸੱਜੇ), ਜਲਣ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਤੋਂ CD8 + T ਸੈੱਲ ਅਤੇ EpCAM + CD45-ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ। (C) ਜਲਣ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ CD4 + ਅਤੇ CD8 + ਸੈੱਲਾਂ (CD3 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ) ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ। (D) ਜਲਣ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ EpCAM + ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ (CD45−)। (E ਅਤੇ F) EpCAM + CD45-ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ EpCAM-CD45-ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ (2-NBDG) (E) ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ (MitoTracker ਗੂੜ੍ਹਾ ਲਾਲ) (F) ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਗ੍ਰਾਫ਼ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਸਾਰਣੀਬੱਧ ਡੇਟਾ (ਸੱਜੇ) ਜਲਣ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ। (G) ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ CD25, CD137 ਅਤੇ PD1 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਗ੍ਰਾਫ਼। (H ਅਤੇ I) CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ (H) ਅਤੇ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ (I) 'ਤੇ CD25, CD137 ਅਤੇ PD1 ਸਮੀਕਰਨ। (J ਅਤੇ K) CCR7 ਅਤੇ CD45RO ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਭੋਲਾ, ਕੇਂਦਰੀ ਮੈਮੋਰੀ (Tcm), ਪ੍ਰਭਾਵਕ (Teff) ਅਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਮੈਮੋਰੀ (Tem) ਫੀਨੋਟਾਈਪ। ਜਲਣ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ (J) ਅਤੇ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ (K) ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਚਿੱਤਰ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਸਾਰਣੀਕਾਰ ਡੇਟਾ (ਸੱਜੇ)। ਪੇਅਰ ਕੀਤੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ (*P<0.05, **P<0.01 ਅਤੇ ***P<0.001) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ P ਮੁੱਲ। ਲਾਈਨ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ (n = 6) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। FMO, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਘਟਾਓ ਇੱਕ; MFI, ਮੱਧਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ।
ਹੋਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਫੀਨੋਟਾਈਪਿਕ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੋਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ (ਚਿੱਤਰ 1, G ਤੋਂ I) ਅਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਮੈਮੋਰੀ (ਚਿੱਤਰ 1, J ਅਤੇ K) ਐਸਾਈਟਸ (CD3 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ) ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਕਸਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਮਾਰਕਰਾਂ (CD25 ਅਤੇ CD137) ਅਤੇ ਡਿਪਲੀਏਸ਼ਨ ਮਾਰਕਰਾਂ [ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਡ ਸੈੱਲ ਡੈਥ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 1 (PD1)] ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਫੀਨੋਟਾਈਪ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਨਾਲ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹਨਾਂ ਆਬਾਦੀਆਂ ਦੀਆਂ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵੱਖਰੀਆਂ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S1, B ਤੋਂ E), ਪਰ ਭੋਲੇ, ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਜਾਂ ਮੈਮੋਰੀ ਸਬਸੈਟਾਂ (ਚਿੱਤਰ S1, F ਤੋਂ I) ਵਿਚਕਾਰ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਅੰਤਰ ਨਿਰੰਤਰ ਨਹੀਂ ਦੇਖੇ ਗਏ। ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਸੈੱਲ ਫੀਨੋਟਾਈਪਾਂ (21) ਨੂੰ ਸਵੈਚਲਿਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਮਸ਼ੀਨ ਸਿਖਲਾਈ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਨੇ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਐਸਾਈਟਸ (ਚਿੱਤਰ S2A) ਵਿੱਚ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਬੋਨ ਮੈਰੋ ਸੈੱਲਾਂ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਸਾਰੀਆਂ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, ਇਸ ਮਾਈਲੋਇਡ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਨੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਿਖਾਈ (ਚਿੱਤਰ S2, B ਤੋਂ G)। ਇਹ ਨਤੀਜੇ HGSC ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਮਲਟੀਪਲ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਅੰਤਰਾਂ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦੇ ਹਨ।
TIL ਦੀਆਂ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਚੁਣੌਤੀ ਟਿਊਮਰਾਂ ਤੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ, ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਵਾਲੇ T ਸੈੱਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ। ਹਾਲੀਆ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਛਾਂਟੀ ਅਤੇ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇ ਤਰੀਕੇ ਸੈਲੂਲਰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਵਿੱਚ ਬਦਲਾਅ ਲਿਆ ਸਕਦੇ ਹਨ (22-24)। ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ LC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸਰਜੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰੀਸੈਕਟ ਕੀਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਤੋਂ TIL ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਅਤੇ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਇਆ (ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ ਵੇਖੋ; ਚਿੱਤਰ 2A)। ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਤਬਦੀਲੀਆਂ 'ਤੇ ਇਸ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਸਮੁੱਚੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਉਪਰੋਕਤ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਵੱਖ ਹੋਣ ਦੇ ਪੜਾਅ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਉਨ੍ਹਾਂ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜੋ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਪਰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਰਿਹਾ। ਇਸ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਪਾਇਆ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਸਥਿਤੀਆਂ (r = 0.77) ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਉੱਚ ਸਬੰਧ ਹੈ, ਅਤੇ 86 ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਦੇ ਸਮੂਹ ਦੀ ਤਕਨੀਕੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ ਉੱਚ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2B)। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਵਿਧੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰ ਰਹੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਹੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ HGSC ਵਿੱਚ ਖਾਸ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਪਹਿਲਾ ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਲੋਕਾਂ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਜਿਨਸੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੀ ਡੂੰਘੀ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
(ਏ) ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। LC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸੈੱਲ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇ ਲਗਾਤਾਰ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣਗੇ ਜਾਂ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਰਹਿਣਗੇ। (ਬੀ) ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਭਰਪੂਰਤਾ 'ਤੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਿਸਮ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ। ਹਰੇਕ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕਿਸਮ ± SE ਲਈ ਤਿੰਨ ਮਾਪਾਂ ਦਾ ਔਸਤ। ਸਲੇਟੀ ਰੇਖਾ 1:1 ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਧੁਰੀ ਲੇਬਲ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਮਾਪਾਂ ਦਾ ਇੰਟਰਾ-ਕਲਾਸ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ (ICC)। NAD, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਐਡੀਨਾਈਨ ਡਾਇਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ। (ਸੀ) ਮਰੀਜ਼ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਵਰਕਫਲੋ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। ਐਸਾਈਟਸ ਜਾਂ ਟਿਊਮਰ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਤੋਂ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਕ੍ਰਾਇਓਪ੍ਰੀਜ਼ਰਵ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਜਿਹੇ ਹਿੱਸੇ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਬਾਕੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ CD4+, CD8+ ਅਤੇ CD45- ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇ ਤਿੰਨ ਦੌਰ ਸਨ। ਇਹਨਾਂ ਸੈੱਲ ਅੰਸ਼ਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ LC-MS/MS ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। (ਡੀ) ਮਾਨਕੀਕ੍ਰਿਤ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਭਰਪੂਰਤਾ ਦਾ ਗਰਮੀ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ। ਡੈਂਡਰੋਗ੍ਰਾਮ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਯੂਕਲੀਡੀਅਨ ਦੂਰੀਆਂ ਦੇ ਵਾਰਡ ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (E) ਨਮੂਨਾ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਨਕਸ਼ੇ ਦਾ ਮੁੱਖ ਭਾਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (PCA), ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦੀਆਂ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਇੱਕੋ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਇੱਕ ਲਾਈਨ ਦੁਆਰਾ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ। (F) ਮਰੀਜ਼ 'ਤੇ ਕੰਡੀਸ਼ਨ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਦਾ PCA (ਭਾਵ, ਅੰਸ਼ਕ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ); ਨਮੂਨਾ ਕਿਸਮ ਕਨਵੈਕਸ ਹਲ ਦੁਆਰਾ ਸੀਮਿਤ ਹੈ। PC1, ਮੁੱਖ ਭਾਗ 1; PC2, ਮੁੱਖ ਭਾਗ 2।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਛੇ HGSC ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ CD4 +, CD8 + ਅਤੇ CD45-ਸੈੱਲ ਫਰੈਕਸ਼ਨਾਂ ਵਿੱਚ 99 ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇਸ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 2C, ਚਿੱਤਰ S3A ਅਤੇ ਟੇਬਲ S3 ਅਤੇ S4)। ਦਿਲਚਸਪੀ ਦੀ ਆਬਾਦੀ ਜੀਵਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੂਲ ਵੱਡੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ 2% ਤੋਂ 70% ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਦਿਲਚਸਪੀ ਦਾ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਅੰਸ਼ (CD4+, CD8+ ਜਾਂ CD45-) ਔਸਤਨ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਜੀਵਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ 85% ਤੋਂ ਵੱਧ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹੈ। ਇਹ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਧੀ ਸਾਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਟਿਊਮਰ ਟਿਸ਼ੂ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਤੋਂ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਡੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ ਕਰਨਾ ਅਸੰਭਵ ਹੈ। ਇਸ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ l-kynurenine ਅਤੇ adenosine, ਇਹ ਦੋ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲੇ ਇਮਯੂਨੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਟਿਊਮਰ T ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ S3, B ਅਤੇ C) ਵਿੱਚ ਉੱਚੀਆਂ ਸਨ। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਜੈਵਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਲੱਭਣ ਲਈ ਸਾਡੀ ਸੈੱਲ ਵਿਭਾਜਨ ਅਤੇ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਦੀ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਅਤੇ ਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
ਸਾਡੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਿਭਾਜਨ ਦਾ ਵੀ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 2D ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S4A)। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਦੂਜੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਮਰੀਜ਼ 70 ਨੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ (ਚਿੱਤਰ 2E ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S4B) ਦਿਖਾਈਆਂ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਕਾਫ਼ੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਦੂਜੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ (1.2 ਤੋਂ 2 ਲੀਟਰ; ਟੇਬਲ S1) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਮਰੀਜ਼ 70 (80 ਮਿ.ਲੀ.) ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜਲਣ ਦੀ ਕੁੱਲ ਮਾਤਰਾ ਘੱਟ ਸੀ। ਮੁੱਖ ਭਾਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੌਰਾਨ ਅੰਤਰ-ਮਰੀਜ਼ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਨਿਯੰਤਰਣ (ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਅੰਸ਼ਕ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ) ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਇਕਸਾਰ ਬਦਲਾਅ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਨੂੰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ (ਚਿੱਤਰ 2F) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਿੰਗਲ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੱਤਾ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਅਤੇ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿਚਕਾਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅੰਤਰ MNA ਹੈ, ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ CD45- ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ CD4+ ਅਤੇ CD8+ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ ਘੁਸਪੈਠ ਕਰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 3A)। CD4 + ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ, ਇਹ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸਭ ਤੋਂ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੈ, ਅਤੇ CD8 + ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਵੀ ਵਾਤਾਵਰਣ ਦੁਆਰਾ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦਾ ਜਾਪਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਛੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਿਰਫ਼ ਤਿੰਨ ਦਾ ਹੀ ਟਿਊਮਰ CD8+ ਸਕੋਰ ਲਈ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। MNA ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ, TIL ਵਿੱਚ ਮਾੜੇ ਗੁਣਾਂ ਵਾਲੇ ਹੋਰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਵੀ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਮੀਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S3 ਅਤੇ S4)। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਹੋਰ ਖੋਜ ਲਈ ਇਮਯੂਨੋਮੋਡਿਊਲੇਟਰੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੇ ਇੱਕ ਵਾਅਦਾ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।
(ਏ) ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਤੋਂ CD4+, CD8+ ਅਤੇ CD45- ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਦੀ ਆਮ ਸਮੱਗਰੀ। ਬਾਕਸ ਪਲਾਟ ਮੱਧਮ (ਰੇਖਾ), ਇੰਟਰਕੁਆਰਟਾਈਲ ਰੇਂਜ (ਫ੍ਰੇਮ ਹਿੰਜ) ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਰੇਂਜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਇੰਟਰਕੁਆਰਟਾਈਲ ਰੇਂਜ (ਫ੍ਰੇਮ ਵਿਸਕਰ) ਤੋਂ 1.5 ਗੁਣਾ ਤੱਕ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਮਰੀਜ਼ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, P ਮੁੱਲ (*P<0.05 ਅਤੇ **P<0.01) ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਲਿਮਾ ਮੁੱਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। (ਬੀ) MNA ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ (60)। ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ: S-ਐਡੇਨੋਸਿਲ-1-ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ; SAH, S-ਐਡੇਨੋਸਾਈਨ-1-ਹੋਮੋਸਿਸਟੀਨ; NA, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ; MNA, 1-ਮਿਥਾਈਲਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ; 2-PY, 1-ਮਿਥਾਈਲ- 2-ਪਾਈਰੀਡੋਨ-5-ਕਾਰਬੋਕਸਾਮਾਈਡ; 4-PY, 1-ਮਿਥਾਈਲ-4-ਪਾਈਰੀਡੋਨ-5-ਕਾਰਬੋਕਸਾਮਾਈਡ; NR, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਰਾਈਬੋਜ਼; NMN, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਮੋਨੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ। ਐਨਜ਼ਾਈਮ (ਹਰਾ): NNMT, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ N-ਮਿਥਾਈਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼; SIRT, sirtuins; NAMPT, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਫਾਸਫੋਰੀਬੋਸਿਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼; AOX1, ਐਲਡੀਹਾਈਡ ਆਕਸੀਡੇਜ਼ 1; NRK, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਰਾਈਬੋਸਾਈਡ ਕਾਇਨੇਜ; NMNAT, ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਮੋਨੋ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਐਡੀਨਾਈਲੇਟ ਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼; Pnp1, ਪਿਊਰੀਨ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਜ਼। (C) ਐਸਾਈਟਸ (ਸਲੇਟੀ) ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ (ਲਾਲ; n = 3 ਮਰੀਜ਼) ਦੇ scRNA-seq ਦਾ t-SNE। (D) scRNA-seq ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀਆਂ ਵਿੱਚ NNMT ਸਮੀਕਰਨ। (E) SK-OV-3, ਮਨੁੱਖੀ ਭਰੂਣ ਗੁਰਦੇ (HEK) 293T, T ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ MNA-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ NNMT ਅਤੇ AOX1 ਦਾ ਸਮੀਕਰਨ। ਫੋਲਡ ਸਮੀਕਰਨ SK-OV-3 ਦੇ ਸਾਪੇਖਕ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। SEM ਦੇ ਨਾਲ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਟਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (n = 6 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ)। 35 ਤੋਂ ਵੱਧ Ct ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਅਣਪਛਾਣਯੋਗ (UD) ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (F) SK-OV-3, HEK293T, T ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ 8mM MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ SLC22A1 ਅਤੇ SLC22A2 ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ। ਫੋਲਡ ਸਮੀਕਰਨ SK-OV-3 ਦੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। SEM ਦੇ ਨਾਲ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਟਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (n = 6 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ)। 35 ਤੋਂ ਵੱਧ Ct ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਅਣਪਛਾਣਯੋਗ (UD) ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (G) MNA ਨਾਲ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ MNA ਸਮੱਗਰੀ। SEM ਦੇ ਨਾਲ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਟਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (n = 4 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ)।
ਐਮਐਨਏ ਮਿਥਾਈਲ ਗਰੁੱਪ ਨੂੰ ਐਸ-ਐਡੀਨੋਸਿਲ-1-ਮੈਥੀਓਨਾਈਨ (ਐਸਏਐਮ) ਤੋਂ ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ (ਐਨਏ) ਵਿੱਚ ਨਿਕੋਟੀਨਾਮਾਈਡ ਐਨ-ਮਿਥਾਈਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼ (ਐਨਐਨਐਮਟੀ; ਚਿੱਤਰ 3ਬੀ) ਦੁਆਰਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਕੇ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਐਨਐਨਐਮਟੀ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਸਾਰ, ਹਮਲੇ ਅਤੇ ਮੈਟਾਸਟੇਸਿਸ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (25-27)। ਟੀਐਮਈ ਵਿੱਚ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਐਮਐਨਏ ਦੇ ਸਰੋਤ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸਮਝਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਤਿੰਨ ਐਚਜੀਐਸਸੀ ਮਰੀਜ਼ਾਂ (ਟੇਬਲ ਐਸ 5) ਦੇ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਐਨਐਨਐਮਟੀ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ scRNA-seq ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਲਗਭਗ 6,500 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ, ਐਨਐਨਐਮਟੀ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ (ਚਿੱਤਰ 3, ਸੀ ਅਤੇ ਡੀ) ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਸੀ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਕਿਸੇ ਵੀ ਆਬਾਦੀ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ NNMT ਸਮੀਕਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ ਜੋ PTPRC (CD45 +) (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5A) ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ MNA ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਐਲਡੀਹਾਈਡ ਆਕਸੀਡੇਸ 1 (AOX1) ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ MNA ਨੂੰ 1-ਮਿਥਾਈਲ-2-ਪਾਈਰੀਡੋਨ-5-ਕਾਰਬੌਕਸਾਮਾਈਡ (2-PYR) ਜਾਂ 1-ਮਿਥਾਈਲ-4-ਪਾਈਰੀਡੋਨ-5-ਕਾਰਬੌਕਸਾਮਾਈਡ (4- PYR) ਵਿੱਚ ਬਦਲਦਾ ਹੈ; ਚਿੱਤਰ 3B) COL1A1 (ਚਿੱਤਰ S5A) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਾਂ ਦੀ ਆਬਾਦੀ ਤੱਕ ਵੀ ਸੀਮਤ ਹੈ, ਜੋ ਇਕੱਠੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਰਵਾਇਤੀ MNA ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ MNA-ਸਬੰਧਤ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ HGSC ਮਰੀਜ਼ਾਂ (ਚਿੱਤਰ S5B; n = 6) (16) ਤੋਂ ਐਸਾਈਟਸ ਤੋਂ ਦੂਜੇ ਸੁਤੰਤਰ ਸੈੱਲ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (qPCR) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਕੰਟਰੋਲ SK-OV-3 ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, NNMT ਜਾਂ AOX1 ਲਗਭਗ ਪ੍ਰਗਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3E)। ਇਹ ਅਣਕਿਆਸੇ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ MNA ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਾਂ ਜਾਂ ਟਿਊਮਰਾਂ ਤੋਂ TME ਵਿੱਚ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਛੁਪਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਕੈਰੀਅਰ 22 (SLC22) ਪਰਿਵਾਰ (SLC22A1, SLC22A2 ਅਤੇ SLC22A3) ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜੈਵਿਕ ਕੈਸ਼ਨ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ 1 ਤੋਂ 3 (OCT1, OCT2 ਅਤੇ OCT3) ਦਾ ਪਰਿਵਾਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, MNA ਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਅਜੇ ਵੀ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਨਹੀਂ ਹਨ (28)। ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ mRNA ਦੇ QPCR ਨੇ SLC22A1 ਦੇ ਘੱਟ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰ ਦਿਖਾਏ ਪਰ SLC22A2 ਦੇ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪੱਧਰ ਦਿਖਾਏ, ਜਿਸ ਨੇ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਕਿ ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਸਾਹਿਤ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3F) (29)। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, SK-OV-3 ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਨੇ ਦੋਵਾਂ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3F) ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ।
ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਐਮਐਨਏ ਨੂੰ ਜਜ਼ਬ ਕਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਐਮਐਨਏ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਹਰੀ ਐਮਐਨਏ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ, ਐਮਐਨਏ ਦੀ ਸੈਲੂਲਰ ਸਮੱਗਰੀ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ (ਚਿੱਤਰ 3G)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਬਾਹਰੀ ਐਮਐਨਏ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਰਗਰਮ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਐਮਐਨਏ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ ਖੁਰਾਕ-ਨਿਰਭਰ ਵਾਧਾ ਦਿਖਾਇਆ, 6 ਐਮਐਮ ਐਮਐਨਏ ਤੱਕ (ਚਿੱਤਰ 3G)। ਇਹ ਨਤੀਜਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਘੱਟ ਪੱਧਰ ਅਤੇ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਐਮਐਨਏ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਮੁੱਖ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਘਾਟ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਟੀਆਈਐਲ ਅਜੇ ਵੀ ਐਮਐਨਏ ਲੈ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਐਮਐਨਏ ਸੋਖਣ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦਾ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੈਂਸਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਸ (ਸੀਏਐਫ) ਐਮਐਨਏ ਨੂੰ ਛੁਪਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਟੀਆਈਐਲ ਦੇ ਫੀਨੋਟਾਈਪ ਅਤੇ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਐਮਐਨਏ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਐਮਐਨਏ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਵਿੱਚ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਕਾਈਨ ਉਤਪਾਦਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਖੁਰਾਕ 'ਤੇ ਐਮਐਨਏ ਜੋੜਨ ਦੇ 7 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਆਬਾਦੀ ਦੁੱਗਣੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਮੱਧਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਾਰੀਆਂ ਖੁਰਾਕਾਂ 'ਤੇ ਜੋਸ਼ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 4A)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਕਸੋਜੇਨਸ ਐਮਐਨਏ ਦੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਟਿਊਮਰ ਨੈਕਰੋਸਿਸ ਫੈਕਟਰ-α (TNFα; ਚਿੱਤਰ 4B) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ CD4 + ਅਤੇ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, IFN-γ ਦਾ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਉਤਪਾਦਨ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ, ਅਤੇ ਇੰਟਰਲਿਊਕਿਨ 2 (IL-2; ਚਿੱਤਰ 4, C ਅਤੇ D) ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਆਇਆ। ਇਸ ਲਈ, ਇਹਨਾਂ MNA-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ T ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਤੋਂ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟਸ ਦੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮ-ਲਿੰਕਡ ਇਮਯੂਨੋਸੋਰਬੈਂਟ ਅਸੇ (ELISA) ਨੇ TNFα ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ, IFN-γ ਵਿੱਚ ਕਮੀ, ਅਤੇ IL-2 ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ (ਚਿੱਤਰ 4, E ਤੋਂ G)। IFN-γ ਦੀ ਕਮੀ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ MNA T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਐਂਟੀ-ਟਿਊਮਰ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। T ਸੈੱਲ-ਮਾਧਿਅਮ ਵਾਲੇ ਸਾਇਟੋਟੌਕਸਿਟੀ 'ਤੇ MNA ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਹਰੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (GFP) -CAR-T) ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਫੋਲੇਟ ਰੀਸੈਪਟਰ α ਅਤੇ CAR-T (GFP) ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਚਾਈਮੇਰਿਕ ਐਂਟੀਜੇਨ ਰੀਸੈਪਟਰ T (FRα-CAR-T) ਸੈੱਲ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਪੈਰੀਫਿਰਲ ਬਲੱਡ ਮੋਨੋਨਿਊਕਲੀਅਰ ਸੈੱਲਾਂ (PBMC) ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ MNA ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 10:1 ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਤੋਂ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਫੋਲੇਟ ਰੀਸੈਪਟਰ α ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਮਨੁੱਖੀ SK-OV-3 ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਸਹਿ-ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MNA ਇਲਾਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ FRα-CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਾਰੂ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਆਈ, ਜੋ ਕਿ ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ FRα-CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 4H)।
(A) ਦਿਨ 7 'ਤੇ ਕਲਚਰ ਤੋਂ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੁੱਲ ਵਿਵਹਾਰਕ ਸੈੱਲ ਗਿਣਤੀ ਅਤੇ ਆਬਾਦੀ ਦੁੱਗਣੀ (PD)। ਬਾਰ ਗ੍ਰਾਫ ਛੇ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀਆਂ ਦੇ ਔਸਤ + SEM ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (B ਤੋਂ D) CD3/CD28 ਅਤੇ IL-2 ਦੀ ਵਰਤੋਂ 7 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ MNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ PMA/ionomycin ਨਾਲ GolgiStop ਨਾਲ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਉਤੇਜਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα (B) ਸਮੀਕਰਨ। ਉਦਾਹਰਨ ਚਿੱਤਰ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਜੀਵਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਸਾਰਣੀਗਤ ਡੇਟਾ (ਸੱਜੇ)। T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ IFN-γ (C) ਅਤੇ IL-2 (D) ਸਮੀਕਰਨ। ਸਾਈਟੋਕਾਈਨਜ਼ ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਵਾਹ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਰ ਗ੍ਰਾਫ ਔਸਤ (n = 6 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀਆਂ) + SEM ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। P ਮੁੱਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਤੇ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਮਾਪਾਂ (*P<0.05 ਅਤੇ **P<0.01) ਦੇ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (E ਤੋਂ G) CD3/CD28 ਅਤੇ IL-2 ਦੀ ਵਰਤੋਂ 7 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ MNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। PMA/ionomycin ਉਤੇਜਨਾ ਦੇ 4 ਘੰਟੇ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਮਾਧਿਅਮ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। TNFα (E), IFN-γ (F) ਅਤੇ IL-2 (G) ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ELISA ਦੁਆਰਾ ਮਾਪੀ ਗਈ ਸੀ। ਬਾਰ ਗ੍ਰਾਫ ਔਸਤ (n = 5 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ) + SEM ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। P ਮੁੱਲ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਤੇ ਦੁਹਰਾਏ ਗਏ ਮਾਪਾਂ (*P<0.05) ਦੇ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਖੋਜ ਦੀ ਖੋਜ ਸੀਮਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। (H) ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਅਸੇ। FRα-CAR-T ਜਾਂ GFP-CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਾਂ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ (Ctrl) ਛੱਡ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। SK-OV-3 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਹੱਤਿਆ ਮਾਪੀ ਗਈ ਸੀ। P ਮੁੱਲ ਵੇਲਚ ਟੀ ਟੈਸਟ (*P<0.5 ਅਤੇ **P<0.01) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
MNA-ਨਿਰਭਰ TNFα ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਨਿਯਮ ਦੀ ਇੱਕ ਮਕੈਨੀਕਲ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, MNA-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ TNFα mRNA ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (ਚਿੱਤਰ 5A)। MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ T ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ TNFα ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪੱਧਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋ ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ MNA TNFα ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਨਿਯਮ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਹੈ। ਇਸ ਸੰਭਾਵੀ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, TNFα ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਦੋ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਾਰਕ, ਅਰਥਾਤ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ T ਸੈੱਲ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਫੈਕਟਰ (NFAT) ਅਤੇ ਖਾਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 1 (Sp1), ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ MNA ਨੂੰ ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ (30) ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਵਿੱਚ 6 ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ NFAT ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਅਤੇ 2 Sp1 ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਹਨ, ਇੱਕ ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ [-55 ਬੇਸ ਜੋੜੇ (bp) 5'cap ਤੋਂ] (30)। ਕ੍ਰੋਮੈਟਿਨ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ (ChIP) ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜਦੋਂ MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨਾਲ Sp1 ਦਾ ਬਾਈਡਿੰਗ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾ ਵਧ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। NFAT ਦਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣਾ ਵੀ ਵਧਿਆ ਅਤੇ ਮਹੱਤਵ ਦੇ ਨੇੜੇ ਪਹੁੰਚ ਗਿਆ (ਚਿੱਤਰ 5B)। ਇਹ ਅੰਕੜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ MNA Sp1 ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰਾਹੀਂ TNFα ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੁਝ ਹੱਦ ਤੱਕ NFAT ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ।
(A) MNA ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਾ ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ। SEM ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਾ ਪੈਟਰਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (n = 5 ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ)। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (B) NFAT ਅਤੇ Sp1 ਤੋਂ ਬਾਅਦ 8 mM MNA ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨੂੰ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ (Ctrl) ਅਤੇ PMA/ionomycin ਉਤੇਜਨਾ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ G (IgG) ਅਤੇ H3 ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਲਈ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਅਤੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ChIP ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ MNA-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨਾਲ Sp1 ਅਤੇ NFAT ਦਾ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਕਈ ਗੁਣਾ ਵਧਿਆ ਹੈ। ਘੱਟੋ-ਘੱਟ n = 3 ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਕਈ ਟੀ-ਟੈਸਟ (*** P <0.01) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ P ਮੁੱਲ। (C) HGSC ਦੇ ਐਸਾਈਟਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, T ਸੈੱਲਾਂ (ਗੈਰ-ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਕ) ਨੇ ਟਿਊਮਰ ਵਿੱਚ TNF ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਦਿਖਾਇਆ। ਰੰਗ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ 300 ਤੱਕ ਨਮੂਨਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਓਵਰਡਰਾਇੰਗ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰਨ ਲਈ ਹਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (** ਪੈਡਜ = 0.0076)। (ਡੀ) ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਲਈ MNA ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਮਾਡਲ। MNA TME ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। MNA Sp1 ਦੇ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨਾਲ ਬੰਧਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ TNFα ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ TNFα ਸਾਇਟੋਕਾਈਨ ਉਤਪਾਦਨ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। MNA IFN-γ ਵਿੱਚ ਵੀ ਕਮੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ। T ਸੈੱਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਨਾਲ ਮਾਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਘੱਟ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ।
ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, TNFα ਦੇ ਅੱਗੇ ਅਤੇ ਪਿੱਛੇ-ਨਿਰਭਰ ਐਂਟੀ-ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਟਿਊਮਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹਨ, ਪਰ ਇਸਦੀ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਮੈਟਾਸਟੈਸਿਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਜਾਣੀ-ਪਛਾਣੀ ਭੂਮਿਕਾ ਹੈ (31-33)। ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ TNFα ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਸੁਭਾਵਕ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਹੈ (34-36)। ਵਿਧੀ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, TNFα ਚਿੱਟੇ ਖੂਨ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ, ਕਾਰਜ ਅਤੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਫੀਨੋਟਾਈਪ ਨੂੰ ਬਦਲ ਸਕਦਾ ਹੈ (37, 38)। ਇਹਨਾਂ ਖੋਜਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਵਿਭਿੰਨ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ TNF ਨੂੰ ਐਸਾਈਟਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਟਿਊਮਰ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਿਯਮਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 5C)। TNF ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਕ ਫੀਨੋਟਾਈਪ (ਚਿੱਤਰ S5A) ਵਾਲੇ T ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਵਿੱਚ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਇਸ ਵਿਚਾਰ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ MNA ਦੇ HGSC ਵਿੱਚ ਦੋਹਰੇ ਇਮਯੂਨੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹਨ।
ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਲੇਬਲਿੰਗ TIL ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਦਾ ਮੁੱਖ ਤਰੀਕਾ ਬਣ ਗਿਆ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਸੈਕੰਡਰੀ ਲਿਮਫੋਇਡ ਅੰਗਾਂ ਤੋਂ ਪੈਰੀਫਿਰਲ ਬਲੱਡ ਲਿਮਫੋਸਾਈਟਸ ਜਾਂ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਮੂਰੀਨ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ TIL ਵਿੱਚ ਗਲੂਕੋਜ਼ (4, 39) ਨੂੰ ਗ੍ਰਹਿਣ ਕਰਨ ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦਾ ਹੌਲੀ ਹੌਲੀ ਨੁਕਸਾਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (19, 40)। ਹਾਲਾਂਕਿ ਅਸੀਂ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ ਨਤੀਜੇ ਦੇਖੇ ਹਨ, ਮੁੱਖ ਵਿਕਾਸ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਅਤੇ ਉਸੇ ਰੀਸੈਕਟ ਕੀਤੇ ਟਿਊਮਰ ਟਿਸ਼ੂ ਤੋਂ TIL ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨਾ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਪਿਛਲੀਆਂ ਕੁਝ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਤੋਂ ਟਿਊਮਰ (CD45-EpCAM +) ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ CD8 + ਅਤੇ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇਹ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਉੱਚ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਦੀ ਤੁਲਨਾ T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। T ਸੈੱਲ ਮੁਕਾਬਲੇ ਦੀ ਧਾਰਨਾ। TME। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਪਰ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਉੱਭਰ ਰਹੇ ਥੀਮ ਨੂੰ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ (41, 42)। ਉਹ ਇਹ ਵੀ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ CD8 + T ਸੈੱਲ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜਾਂ CD4 + T ਸੈੱਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਲਈ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਾਰਬਨ ਸਰੋਤਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ (43, 44)। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਅਸੀਂ ਐਸਾਈਟਸ ਵਿੱਚ CD4 + T ਪ੍ਰਭਾਵਕਾਂ, T ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਮੈਮੋਰੀ ਅਤੇ T ਕੇਂਦਰੀ ਮੈਮੋਰੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਜਾਂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਟਿਊਮਰਾਂ ਵਿੱਚ CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨਾਲ ਕੋਈ ਲੈਣਾ-ਦੇਣਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ TIL ਵਿਚਕਾਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ (22)। ਇਹਨਾਂ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਨਿਰਪੱਖ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਵੰਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਨੇ ਅੱਗੇ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਕਿ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲੇ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਚਲਿਤ ਹਨ ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਆਬਾਦੀ scRNA-seq ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਾਈਲੋਇਡ ਸਪ੍ਰੈਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾਸਾਈਟੋਇਡ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪੁਟੇਟਿਵ ਉਪ-ਜਨਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਦੋਵੇਂ ਮਨੁੱਖੀ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ [45] ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਫਿਰ ਵੀ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਇਸ ਮਾਈਲੋਇਡ ਉਪ-ਜਨਸੰਖਿਆ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਕੰਮ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ-ਅਧਾਰਿਤ ਵਿਧੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਅਤੇ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਵਿੱਚ ਆਮ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, TME ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਲਈ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਜਾਂ ਹੋਰ ਕਾਰਬਨ ਸਰੋਤਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਹੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਅਜੇ ਤੱਕ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਦਿੱਤੇ ਗਏ TIL ਸਬਸੈੱਟ ਨੂੰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਐਕਸਾਈਜ਼ਡ ਟਿਸ਼ੂ ਤੋਂ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸਾਡਾ ਸੈੱਲ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਧੀ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਵਿੱਚ ਸੂਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ-ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਸੈੱਲ ਛਾਂਟੀ ਨਾਲੋਂ ਫਾਇਦੇ ਹਨ, ਕੁਝ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸਥਿਰਤਾ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਤੇਜ਼ ਟਰਨਓਵਰ ਦਰ (22) ਦੇ ਕਾਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ। ਫਿਰ ਵੀ, ਸਾਡਾ ਤਰੀਕਾ ਦੋ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਇਮਯੂਨੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ, ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਅਤੇ ਕਾਈਨੂਰੀਨਾਈਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਨਮੂਨੇ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ TIL ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ ਦਾ ਸਾਡਾ ਮੈਟਾਬੋਨੋਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅੰਡਕੋਸ਼ TME ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਬਾਰੇ ਵਧੇਰੇ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਪਹਿਲਾਂ, ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ CD4 + T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਸੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, LC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਇਹਨਾਂ ਆਬਾਦੀਆਂ ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਭਰਪੂਰਤਾ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ TIL ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਸਮੁੱਚੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਬਾਰੇ ਸਿੱਟਿਆਂ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਵਿਆਖਿਆ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਦੂਜਾ, MNA ਉਹ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ CD45-ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਐਸਾਈਟਸ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡਾ ਅੰਤਰ ਹੈ, ਟਿਊਮਰ ਨਹੀਂ। ਇਸ ਲਈ, ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸਥਾਨ TIL ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ 'ਤੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿਸੇ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵਿਤ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਤੀਜਾ, MNA-ਉਤਪਾਦਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ NNMT ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ CAF ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਘੱਟ ਹੱਦ ਤੱਕ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਹੈ, ਪਰ ਟਿਊਮਰ-ਪ੍ਰਾਪਤ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਖੋਜਣਯੋਗ MNA ਪੱਧਰ ਦੇਖੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਅੰਡਕੋਸ਼ CAF ਵਿੱਚ NNMT ਦੇ ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਦਾ ਇੱਕ ਜਾਣਿਆ-ਪਛਾਣਿਆ ਕੈਂਸਰ-ਪ੍ਰਮੋਟ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ CAF ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ, ਟਿਊਮਰ ਹਮਲੇ ਅਤੇ ਮੈਟਾਸਟੇਸਿਸ (27) ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਕਾਰਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ TIL ਦਾ ਸਮੁੱਚਾ ਪੱਧਰ ਦਰਮਿਆਨਾ ਹੈ, CAF ਵਿੱਚ NNMT ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਕੈਂਸਰ ਜੀਨੋਮ ਐਟਲਸ (TCGA) ਮੇਸੇਨਚਾਈਮਲ ਉਪ-ਕਿਸਮ ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਸਬੰਧਤ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮਾੜੇ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ (27, 46, 47) ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, MNA ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਐਂਜ਼ਾਈਮ AOX1 ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਵੀ CAF ਆਬਾਦੀ ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਨੂੰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਇਸ ਵਿਚਾਰ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਖੋਜ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਕੰਮ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ ਇੱਕ ਇਮਯੂਨੋਸਪ੍ਰੈਸਿਵ CAF ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
MNA ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟਰਾਂ ਦੇ ਘੱਟ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰ ਅਤੇ MNA ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਮੁੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ MNA ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਅਚਾਨਕ ਹੈ। ਨਾ ਤਾਂ NNMT ਅਤੇ ਨਾ ਹੀ AOX1 ਨੂੰ scRNA-seq ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ qPCR ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਿਆ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ MNA T ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ TME ਤੋਂ ਲੀਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ T ਸੈੱਲ ਬਾਹਰੀ MNA ਇਕੱਠਾ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਸਾਡੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਬਾਹਰੀ MNA T ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨਾਲ Sp1 ਦੇ ਬੰਧਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ TNFα ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ-ਵਿਰੋਧੀ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ-ਵਿਰੋਧੀ ਦੋਵੇਂ ਕਾਰਜ ਹਨ, ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਵਿੱਚ, TNFα ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (31-33)। ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ TNFα ਦਾ ਨਿਰਪੱਖੀਕਰਨ ਜਾਂ ਮਾਊਸ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ TNFα ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਖਾਤਮਾ TNFα-ਵਿਰੋਧੀ ਸੋਜਸ਼ ਸਾਈਟੋਕਾਈਨ ਉਤਪਾਦਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਵਾਧੇ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ (32, 35)। ਇਸ ਲਈ, ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, TME-ਪ੍ਰਾਪਤ MNA ਆਟੋਕ੍ਰਾਈਨ ਲੂਪ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ TNFα-ਨਿਰਭਰ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋ-ਇਨਫਲੇਮੇਟਰੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਅਤੇ ਫੈਲਾਅ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ (31)। ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, TNFα ਨਾਕਾਬੰਦੀ ਦਾ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਇਲਾਜ ਏਜੰਟ ਵਜੋਂ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਰਿਹਾ ਹੈ (37, 48, 49)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, MNA CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਟੀ ਨੂੰ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਗਾੜਦਾ ਹੈ, MNA-ਵਿਰੋਧੀ ਇਮਿਊਨ ਦਮਨ ਲਈ ਹੋਰ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ CAF ਸੈੱਲ MNA ਨੂੰ ਬਾਹਰੀ ਸੈੱਲ TME ਵਿੱਚ ਛੁਪਾਉਂਦੇ ਹਨ। (i) TNF-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਕੈਂਸਰ ਵਿਕਾਸ ਉਤੇਜਨਾ ਅਤੇ (ii) MNA-ਪ੍ਰੇਰਿਤ T ਸੈੱਲ ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਰੋਕ ਦੁਆਰਾ, ਇਸਦਾ ਦੋਹਰਾ ਟਿਊਮਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5D)।
ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਤੇਜ਼ ਸੈੱਲ ਸੰਸ਼ੋਧਨ, ਸਿੰਗਲ-ਸੈੱਲ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਅਤੇ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲਿੰਗ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਕੇ, ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਨੇ HGSC ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਡੇ ਇਮਯੂਨੋਮੈਟਾਬੋਲੋਮਿਕ ਅੰਤਰਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਇਸ ਵਿਆਪਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਗ੍ਰਹਿਣ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਹਨ, ਅਤੇ MNA ਨੂੰ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਸੈੱਲ ਆਟੋਨੋਮਸ ਇਮਿਊਨ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ। ਇਹਨਾਂ ਡੇਟਾ ਦਾ ਇਸ ਗੱਲ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਂਦਾ ਹੈ ਕਿ TME ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀ ਸੈੱਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਪੌਸ਼ਟਿਕ ਤੱਤਾਂ ਲਈ ਸਿੱਧੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਟਿਊਮਰ ਦੀ ਪ੍ਰਗਤੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਦਬਾਉਣ ਲਈ ਅਸਿੱਧੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰਾਂ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਦੀ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਹੋਰ ਵੇਰਵਾ ਟਿਊਮਰ-ਵਿਰੋਧੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਵਿਕਲਪਿਕ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਖੋਲ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਅਤੇ ਕਲੀਨਿਕਲ ਡੇਟਾ ਕੈਨੇਡੀਅਨ ਟਿਸ਼ੂ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ ਨੈੱਟਵਰਕ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਬੀਸੀ ਕੈਂਸਰ ਟਿਊਮਰ ਟਿਸ਼ੂ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ ਰਾਹੀਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਬੀਸੀ ਕੈਂਸਰ ਰਿਸਰਚ ਐਥਿਕਸ ਕਮੇਟੀ ਅਤੇ ਬ੍ਰਿਟਿਸ਼ ਕੋਲੰਬੀਆ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ (H07-00463) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਸਾਰੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਅਤੇ ਕਲੀਨਿਕਲ ਡੇਟਾ ਨੇ ਸੂਚਿਤ ਲਿਖਤੀ ਸਹਿਮਤੀ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂ ਰਸਮੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਪਣੀ ਸਹਿਮਤੀ ਛੱਡ ਦਿੱਤੀ। ਨਮੂਨੇ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਬਾਇਓਬੈਂਕ (BRC-00290) ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਮਰੀਜ਼ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਟੇਬਲ S1 ਅਤੇ S5 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। ਕ੍ਰਾਇਓਪ੍ਰੀਜ਼ਰਵੇਸ਼ਨ ਲਈ, ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਮਕੈਨੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੜਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸਕੈਲਪਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇਸਨੂੰ 100-ਮਾਈਕ੍ਰੋਨ ਫਿਲਟਰ ਰਾਹੀਂ ਧੱਕਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਐਸਾਈਟਸ ਨੂੰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੈਲੇਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ 1500 rpm 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 50% ਤਾਪ-ਨਿਰਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਮਨੁੱਖੀ AB ਸੀਰਮ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ), 40% RPMI-1640 (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਅਤੇ 10% ਡਾਈਮੇਥਾਈਲ ਸਲਫੌਕਸਾਈਡ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਾਇਓਪ੍ਰੀਜ਼ਰਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹਨਾਂ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਪਿਘਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਮੈਟਾਬੋਲੌਮਿਕਸ ਅਤੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਨਿਰਧਾਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪੂਰੇ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ 0.22 μm ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ 50:50 ਪੂਰਕ RPMI 1640 ਹੁੰਦੇ ਹਨ: AimV। RPMI 1640 + 2.05 mM l-ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) 10% ਗਰਮੀ-ਨਿਰਬਲ ਮਨੁੱਖੀ AB ਸੀਰਮ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ), 12.5 mM ਹੀਪਸ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ), 2 mM l-ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ), 1 x ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (ਪੇਨਸਟ੍ਰੈਪ) ਘੋਲ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਅਤੇ 50 μMB-ਮਰਕੈਪਟੋਏਥੇਨੌਲ। AimV (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ) 20 mM ਹੀਪਸ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਅਤੇ 2 mM l-ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਹੈ। ਫਲੋ ਸਾਈਟੋਮੀਟਰ ਸਟੇਨਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 0.22μm ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰਡ ਖਾਰੇ (PBS; ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ) 3% ਗਰਮੀ-ਨਿਰਬਲ AB ਮਨੁੱਖੀ ਸੀਰਮ (ਸਿਗਮਾ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਸੈੱਲ ਐਨਰੀਚਮੈਂਟ ਬਫਰ 0.22μm ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ PBS ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੈ ਅਤੇ 0.5% ਤਾਪ-ਨਿਰਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਮਨੁੱਖੀ AB ਸੀਰਮ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਹੈ।
37°C ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 10 nM MT DR ਅਤੇ 100 μM 2-NBDG ਨਾਲ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਅੱਗੇ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 4°C 'ਤੇ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਡਾਈ eF506 ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। FC ਬਲਾਕ (eBioscience) ਅਤੇ Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕਰੋ, ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੀਟਰ ਸਟੇਨਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ (ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ), ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (ਟੇਬਲ S2) ਦੇ ਸੈੱਟ ਨਾਲ 4°C 'ਤੇ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਸਟੇਨਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਰੰਗੋ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਸਟੇਨਿੰਗ ਬਫਰ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ਸੰਰਚਨਾ) ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕਰੋ। ਸੈੱਲ ਗਿਣਤੀ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ SpectroFlo ਅਤੇ FlowJo V10 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ GraphPad Prism 8 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। 2-NBDG ਅਤੇ MT DR ਦੀ ਮੱਧਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ (MFI) ਨੂੰ ਲੌਗ-ਸਧਾਰਨ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਲਈ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚੋਂ 40 ਤੋਂ ਘੱਟ ਘਟਨਾਵਾਂ ਵਾਲੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਆਬਾਦੀਆਂ ਨੂੰ ਹਟਾਓ; ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਕਿਸੇ ਵੀ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਮੁੱਲ ਲਈ 1 ਦਾ MFI ਮੁੱਲ ਦਰਜ ਕਰੋ।
ਉਪਰੋਕਤ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪੈਨਲ ਦੀ ਮੈਨੂਅਲ ਗੇਟਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ FlowJo ਵਿੱਚ ਮਰੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਸੈੱਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਆਕਾਰ ਪਾਬੰਦੀ ਰੁੱਖ (FAUST) (21) ਦੁਆਰਾ ਪੂਰੀ ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਗਲਤ ਵੰਡੀਆਂ ਜਾਪਦੀਆਂ ਆਬਾਦੀਆਂ (PD1+ ਨੂੰ PD1-ਟਿਊਮਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ) ਅਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਆਬਾਦੀਆਂ ਨੂੰ ਮਿਲਾਉਣ ਲਈ ਆਉਟਪੁੱਟ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਪ੍ਰਬੰਧਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਕੁੱਲ 11 ਆਬਾਦੀਆਂ ਲਈ ਔਸਤਨ 2% ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੈੱਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਫਿਕੋਲ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਡੈਨਸਿਟੀ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੀਬੀਐਮਸੀ ਨੂੰ ਲਿਊਕੋਸਾਈਟ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ (STEMCELL ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। CD8 + T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ CD8 ਮਾਈਕ੍ਰੋਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੀਬੀਐਮਸੀ ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ 2 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਲਈ ਟ੍ਰਾਂਸਐਕਟ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੂਰੇ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਫੈਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ਵਾਲੇ ਪੂਰੇ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ 5 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਖੜ੍ਹੇ ਰਹਿਣ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਟ੍ਰਾਂਸਐਕਟ ਨਾਲ ਦੁਬਾਰਾ ਉਤੇਜਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 7ਵੇਂ ਦਿਨ, ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ, ਮਨੁੱਖੀ CD45 ਮਾਈਕ੍ਰੋਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਲਗਾਤਾਰ ਤਿੰਨ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ) ਲਈ ਅਲਿਕੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ LC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਅਲਿਕੋਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ LC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਹੇਠਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪ੍ਰੋਸੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਸੀਂ ਗੁੰਮ ਹੋਏ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਮੁੱਲ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ 1,000 ਦੇ ਆਇਨ ਨੰਬਰ ਨਾਲ ਲਗਾਇਆ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਕੁੱਲ ਆਇਨ ਨੰਬਰ (TIC) ਦੁਆਰਾ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਲਘੂਗਣਕ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ MetaboAnalystR ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਆਪ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਹਰੇਕ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪਿਘਲਾ ਕੇ 40 μm ਫਿਲਟਰ ਰਾਹੀਂ ਪੂਰੇ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ)। ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, CD8+, CD4+ ਅਤੇ CD45- ਸੈੱਲਾਂ (ਬਰਫ਼ 'ਤੇ) ਲਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮਾਈਕ੍ਰੋਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਾਜਨ ਦੁਆਰਾ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚੋਣ ਦੇ ਤਿੰਨ ਲਗਾਤਾਰ ਦੌਰ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਬਫਰ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ) ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਗਿਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ CD8 ਮਣਕੇ, ਮਨੁੱਖੀ CD4 ਮਣਕੇ ਜਾਂ ਮਨੁੱਖੀ CD45 ਮਣਕੇ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਨਾਲ 4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈੱਲ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਬਫਰ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਾ LS ਕਾਲਮ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਅਤੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਅੰਸ਼ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਮਿਆਦ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਰਿਕਵਰੀ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ, CD8-ਅੰਸ਼ ਨੂੰ ਫਿਰ CD4+ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ CD4-ਅੰਸ਼ ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਦੇ CD45-ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਵੱਖ ਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਘੋਲ ਨੂੰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਰੱਖੋ।
ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਨਮੂਨੇ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਵਾਰ ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ ਨਮਕ ਦੇ ਘੋਲ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ 80% ਮੀਥੇਨੌਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ, ਫਿਰ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਵਿੱਚ ਵੌਰਟੈਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਨੈਪ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਥੌ ਚੱਕਰਾਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 14,000 rpm 'ਤੇ 4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਵਾਲਾ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਸੁੱਕਣ ਤੱਕ ਵਾਸ਼ਪੀਕਰਨ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਨੂੰ 0.03% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਦੇ 50 μl ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ, ਮਿਲਾਉਣ ਲਈ ਵੌਰਟੈਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਕੱਢੋ। ਮੈਟਾਬੋਲੋਮਿਕਸ ਖੋਜ ਲਈ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਉੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਵਾਲੀ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਬੋਤਲ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ। ਬੈਚ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਬੇਤਰਤੀਬ ਇਲਾਜ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਅਸੀਂ AB SCIEX QTRAP 5500 ਟ੍ਰਿਪਲ ਕਵਾਡਰੂਪੋਲ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (50) 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਗਲੋਬਲ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦਾ ਗੁਣਾਤਮਕ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ। ਮਲਟੀਕੁਆਇੰਟ ਵਰਜ਼ਨ 2.1 ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ SCIEX) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਪੀਕ ਏਰੀਆ ਏਕੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਗੁੰਮ ਹੋਏ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਮੁੱਲ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ 1000 ਦੀ ਆਇਨ ਗਿਣਤੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦੇ TIC ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਹਰੇਕ ਖੋਜੇ ਗਏ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਦੇ ਸਧਾਰਣ ਸਿਖਰ ਖੇਤਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਨਮੂਨਾ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਤੋਂ ਯੰਤਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। TIC ਦੇ ਸਧਾਰਣ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, MetaboAnalystR(51) (ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਲਘੂਗਣਕ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਨਾਰਮ ਲਾਈਨ ਸਕੇਲਿੰਗ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਨਮੂਨੇ ਦੀਆਂ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮੈਟਾਬੋਲੌਮ ਅੰਤਰਾਂ ਦਾ ਖੋਜੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ vegan R ਪੈਕੇਜ ਦੇ ਨਾਲ PCA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਅੰਸ਼ਕ ਰਿਡੰਡੈਂਸੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਯੂਕਲੀਡੀਅਨ ਦੂਰੀ ਨੂੰ ਕਲੱਸਟਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਹੀਟ ਮੈਪ ਡੈਂਡਰੋਗ੍ਰਾਮ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਾਰਡ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਅਸੀਂ ਪੂਰੇ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮ ਅਤੇ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਨਕੀਕ੍ਰਿਤ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਭਰਪੂਰਤਾ 'ਤੇ ਲਿਮਾ (52) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। ਵਿਆਖਿਆ ਨੂੰ ਸਰਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸਮੂਹ ਔਸਤ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਸਮੂਹ (n = 6 ਸਮੂਹ) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕਰਦੇ ਹਾਂ; ਮਹੱਤਤਾ ਟੈਸਟ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਹਰੇਕ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਲਈ ਤਿੰਨ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਮਾਪ ਕੀਤੇ। ਗਲਤ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, ਮਰੀਜ਼ ਨੂੰ ਲਿਮਾ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਰੁਕਾਵਟ ਵਜੋਂ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਸਮੇਤ ਲਿਮਾ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ। ਅਸੀਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮ ਅਤੇ ਪੈਡਜ <0.05 (ਬੈਂਜਾਮਿਨੀ-ਹੋਚਬਰਗ ਸੁਧਾਰ) ਦੇ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿਚਕਾਰ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਵਿਪਰੀਤਤਾ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।
ਮਿਲਟੇਨੀ ਡੈੱਡ ਸੈੱਲ ਰਿਮੂਵਲ ਕਿੱਟ (>80% ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਜੋਸ਼ ਵਧਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, 10x 5′ਜੀਨ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੁੱਲ ਲਾਈਵ ਫ੍ਰੋਜ਼ਨ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਨਮੂਨਿਆਂ 'ਤੇ ਸਿੰਗਲ-ਸੈੱਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਵਾਲੇ ਪੰਜ ਕੇਸਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇੱਕ ਟਿਊਮਰ ਨਮੂਨੇ ਤੋਂ ਘੱਟ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਨੇ ਇਸਦੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ। ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਦੀਆਂ ਕਈ ਚੋਣਾਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ 10x ਕ੍ਰੋਮੀਅਮ ਕੰਟਰੋਲਰ ਦੀਆਂ ਲੇਨਾਂ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ, ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਸਾਈਟਾਂ ਦਾ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ [ਇਲੂਮੀਨਾ ਹਾਈਸੇਕ 4000 28×98 ਬੀਪੀ ਪੇਅਰਡ ਐਂਡ (ਪੀਈ), ਕਿਊਬਿਕ ਜੀਨੋਮ; ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀ ਸੈੱਲ ਔਸਤਨ 73,488 ਅਤੇ 41,378 ਰੀਡ ਕ੍ਰਮਵਾਰ]], ਅਸੀਂ CellSNP ਅਤੇ Vireo (53) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ (CellSNP ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ GRCh38 ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਮ ਮਨੁੱਖੀ SNP (VCF) ਨੂੰ ਇੱਕ ਦਾਨੀ ਪਛਾਣ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਮਰੀਜ਼ ਦੇ ਜੀਨੋਟਾਈਪ ਸਥਿਤੀ (IBS) ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਪਛਾਣ (IBS) ਦਾ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਉਣ ਲਈ SNPRelate ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਡੁਪਲੈਕਸ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਦਾਨੀਆਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ (54)। ਇਸ ਕੰਮ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਵਿੱਚ ਭਰਪੂਰ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਵਾਲੇ ਤਿੰਨ ਕੇਸਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ। ਸਕੈਟਰ (55) ਅਤੇ ਸਕ੍ਰੈਨ (56) ਬਾਇਓਕੰਡਕਟਰ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਾਸ ਫਿਲਟਰੇਸ਼ਨ ਕਦਮ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ 6975 ਸੈੱਲ (2792 ਅਤੇ 4183 ਸੈੱਲ ਟਿਊਮਰ ਅਤੇ ਐਸਾਈਟਸ ਤੋਂ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ) ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ। ਅਸੀਂ ਸ਼ੇਅਰਡ ਨੇੜਲਾ ਗੁਆਂਢੀ ਨੈੱਟਵਰਕ (SNN) ਦੇ igraph's (57) Louvain ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਸਮੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਕਲੱਸਟਰ ਸੈੱਲਾਂ ਤੱਕ ਜੈਕਾਰਡ ਦੀ ਦੂਰੀ। ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਨੂੰ ਮਾਰਕਰ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਹੱਥੀਂ ਐਨੋਟੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ t-SNE ਨਾਲ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਈਟੋਟੌਕਸਿਕ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ CD8A ਅਤੇ GZMA ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਘੱਟ ਰਾਈਬੋਸੋਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸਬਕਲੱਸਟਰਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ। ਅਸੀਂ Izar et al. (16) ਦੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਡੇਟਾ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਕੀਤੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ t-SNE ਏਮਬੈਡਿੰਗ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਇਮਿਊਨ ਸੈੱਲ ਮਾਰਕਰਾਂ ਅਤੇ NNMT ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮੀਕਰਨ ਓਵਰਲੈਪ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।
PBMC ਨੂੰ Ficoll ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਘਣਤਾ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਲਿਊਕੋਸਾਈਟ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ (STEMCELL ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। CD3 + ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ CD3 ਬੀਡਸ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ PBMC ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MNA ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਵਿੱਚ, CD3+ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪਲੇਟ-ਬਾਊਂਡ CD3 (5μg/ml), ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ CD28 (3μg/ml) ਅਤੇ IL-2 (300 U/ml; ਪ੍ਰੋਲਿਊਕਿਨ) ਨਾਲ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਵਿਸਥਾਰ ਦੇ ਆਖਰੀ ਦਿਨ, ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ (ਫਿਕਸੇਬਲ ਵਾਈਬਿਲਟੀ ਡਾਈ eFluor450, eBioscience) ਅਤੇ ਪ੍ਰਸਾਰ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। PMA (20 ng/ml) ਅਤੇ ionomycin (1μg/ml) ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ GolgiStop ਨਾਲ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰੋ, ਅਤੇ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ਅਤੇ TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰੋ। 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ PMA (20 ng/ml) ਅਤੇ ionomycin (1μg/ml) ਨਾਲ qPCR ਅਤੇ ChIP ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰੋ। ELISA ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ PMA (20 ng/ml) ਅਤੇ ionomycin (1 μg/ml) ਨਾਲ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ RNA ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰੋ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇਕਸਾਰ ਕਰਨ ਲਈ QIAshredder (QIAGEN) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਪੂਰਕ DNA (cDNA) ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ cDNA ਕਿੱਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਤੋਂ ਉੱਚ-ਸਮਰੱਥਾ ਵਾਲੇ RNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਹੇਠ ਲਿਖੀਆਂ ਪ੍ਰੋਬਾਂ ਨਾਲ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ) ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ TaqMan ਰੈਪਿਡ ਐਡਵਾਂਸਡ ਮਾਸਟਰ ਮਿਕਸ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ਗਲਾਈਸਰਾਲਡੀਹਾਈਡ-3-ਫਾਸਫੇਟ ਆਫ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ (GAPDH)] ਅਤੇ Hs01010726_m1 (SLC22A2)। ਇਹ ਨਮੂਨੇ ਸਟੈਪਵਨਪਲੱਸ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਸਿਸਟਮ (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ) (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ) 'ਤੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਐਂਪ ਆਪਟੀਕਲ ਫਿਲਮ ਦੇ ਨਾਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਐਂਪ ਫਾਸਟ ਆਪਟੀਕਲ 96-ਵੈੱਲ ਰਿਐਕਸ਼ਨ ਪਲੇਟ (ਐਪਲਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿਸਟਮ) ਵਿੱਚ ਚਲਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਕੋਈ ਵੀ Ct ਮੁੱਲ ਜੋ 35 ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਨੂੰ ਖੋਜ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਅਣਪਛਾਤੇ ਵਜੋਂ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ChIP ਕਰੋ (58)। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਫਾਰਮਾਲਡੀਹਾਈਡ (ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 1.42%) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਪੂਰਕ ਸੋਜ ਬਫਰ (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ਅਤੇ 0.1% NP-40) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਫਿਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕਰੋ (58)। ਫਿਰ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਚੱਕਰਾਂ ਨਾਲ ਸੋਨਿਕੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: 10 ਚੱਕਰ (20 1-ਸਕਿੰਟ ਪਲਸ) ਅਤੇ 40 ਸਕਿੰਟ ਦਾ ਸਥਿਰ ਸਮਾਂ। ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਨਾਲ ChIP-ਗ੍ਰੇਡ ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ G (ਸੈੱਲ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ; 1μl), ਹਿਸਟੋਨ H3 (ਸੈੱਲ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ; 3μl), NFAT (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ; 3μl) ਅਤੇ SP1 (ਸੈੱਲ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ; 3μl) ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ 4°CC 'ਤੇ ਸ਼ੇਕ ਕਰੋ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਏ ਬੀਡਜ਼ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਨਾਲ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਹਲਕੇ ਹਿਲਾ ਕੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ, ਫਿਰ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਚੇਲੇਕਸ ਬੀਡਜ਼ (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਾਚਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨੇਸ ਕੇ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। TNFα ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਨੂੰ PCR ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ: ਅੱਗੇ, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ਇਸਦੇ ਉਲਟ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ਉਤਪਾਦ)। ਤਸਵੀਰਾਂ ਇਮੇਜ ਲੈਬ (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ) ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ ਅਤੇ ਇਮੇਜਜੇ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਨ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਮਨੁੱਖੀ TNFα ELISA ਕਿੱਟ (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ), ਮਨੁੱਖੀ IL-2 ELISA ਕਿੱਟ (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ) ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ IFN-γ ELISA ਕਿੱਟ (Abcam) ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ TNFα ਅਤੇ IL-2 ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ 1:100 ਅਤੇ IFN-γ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ 1:3 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 450 nm 'ਤੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ EnVision 2104 ਮਲਟੀਲੇਬਲ ਰੀਡਰ (PerkinElmer) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
PBMC ਨੂੰ Ficoll ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਡੈਨਸਿਟੀ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਲਿਊਕੋਸਾਈਟ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ (STEMCELL ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। CD3 + ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ CD3 ਬੀਡਸ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ PBMC ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MNA ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਵਿੱਚ, CD3+ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪਲੇਟ-ਬਾਊਂਡ CD3 (5μg/ml), ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ CD28 (3μg/ml) ਅਤੇ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ਨਾਲ 3 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 3 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 0.9% ਖਾਰੇ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਸਨੈਪ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੈੱਲ ਗਿਣਤੀ 123count eBeads ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ਸੰਰਚਨਾ) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ। ਸੁੱਕੇ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਨੂੰ 4000 ਸੈੱਲ ਸਮਾਨ/μl ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਪੁਨਰਗਠਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰਿਵਰਸਡ-ਫੇਜ਼ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (1290 ਇਨਫਿਨਿਟੀ II, ਐਜਿਲੈਂਟ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼, ਸੈਂਟਾ ਕਲਾਰਾ, CA) ਅਤੇ CORTECS T3 ਕਾਲਮ (2.1×150 mm, ਕਣ ਦਾ ਆਕਾਰ 1.6-μm, ਪੋਰ ਸਾਈਜ਼ 120-Å; #186008500, ਵਾਟਰਸ) ਦੁਆਰਾ ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰੋ। ਪੋਲਰ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (6470, ਐਜਿਲੈਂਟ), ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਮੋਬਾਈਲ ਫੇਜ਼ A 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (H2O ਵਿੱਚ), ਮੋਬਾਈਲ ਫੇਜ਼ B 90% ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ, 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਹੈ। LC ਗਰੇਡੀਐਂਟ 100% A ਲਈ 0 ਤੋਂ 2 ਮਿੰਟ, 99% B ਲਈ 2 ਤੋਂ 7.1 ਮਿੰਟ, ਅਤੇ 99% B ਲਈ 7.1 ਤੋਂ 8 ਮਿੰਟ ਹੈ। ਫਿਰ 3 ਮਿੰਟ ਲਈ 0.6 ml/min ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 'ਤੇ ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਮੋਬਾਈਲ ਫੇਜ਼ A ਨਾਲ ਦੁਬਾਰਾ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰੋ। . ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 0.4ml/min ਹੈ, ਅਤੇ ਕਾਲਮ ਚੈਂਬਰ ਨੂੰ 50°C ਤੱਕ ਗਰਮ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਧਾਰਨ ਸਮਾਂ (RT) ਅਤੇ ਪਰਿਵਰਤਨ (RT = 0.882 ਮਿੰਟ, ਪਰਿਵਰਤਨ 1 = 137→94.1, ਪਰਿਵਰਤਨ 2 = 137→92, ਪਰਿਵਰਤਨ 3 = 137→78) ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ MNA ਦੇ ਸ਼ੁੱਧ ਰਸਾਇਣਕ ਮਿਆਰ (M320995, ਟੋਰਾਂਟੋ ਰਿਸਰਚ ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪਨੀ, ਉੱਤਰੀ ਯੌਰਕ, ਓਨਟਾਰੀਓ, ਕੈਨੇਡਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਜਦੋਂ ਤਿੰਨੋਂ ਪਰਿਵਰਤਨ ਸਹੀ ਧਾਰਨ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਪਰਿਵਰਤਨ 1 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮਾਤਰਾਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। MNA (ਟੋਰਾਂਟੋ ਰਿਸਰਚ ਕੈਮੀਕਲ ਕੰਪਨੀ) ਦਾ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਸਟਾਕ ਘੋਲ (1 mg/ml) ਦੇ ਛੇ ਸੀਰੀਅਲ ਡਿਲਿਊਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 0.1, 1.0, 10 ਅਤੇ 100 ng/ml ਅਤੇ 1.0 ਅਤੇ 10μg/ml ਤਰਲ ਦੇ ਮਿਆਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਣ। ਖੋਜ ਸੀਮਾ 1 ng/ml ਹੈ, ਅਤੇ ਰੇਖਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ 10 ng/ml ਅਤੇ 10μg/ml ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ। LC/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਨਮੂਨਾ ਅਤੇ ਮਿਆਰ ਦੇ ਦੋ ਮਾਈਕ੍ਰੋਲੀਟਰਾਂ ਦੇ ਹਰੇਕ ਟੀਕੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਹਰ ਅੱਠ ਟੀਕਿਆਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ਮਿਸ਼ਰਤ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਮੂਨਾ ਚਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਾਰੇ MNA-ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ MNA ਜਵਾਬ ਪਰਖ ਦੀ ਰੇਖਿਕ ਸੀਮਾ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਨ। ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ MassHunter ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (v9.0, Agilent) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਦੂਜੀ ਪੀੜ੍ਹੀ αFR-CAR ਬਣਤਰ ਨੂੰ Song et al. (59) ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਹੇਠ ਲਿਖੀਆਂ ਸਮੱਗਰੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ: CD8a ਲੀਡਰ ਕ੍ਰਮ, ਮਨੁੱਖੀ αFR-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸਿੰਗਲ-ਚੇਨ ਵੇਰੀਏਬਲ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟ, CD8a ਹਿੰਗ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਖੇਤਰ, CD27 ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ CD3z ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਡੋਮੇਨ। ਪੂਰਾ CAR ਕ੍ਰਮ GenScript ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ GFP ਸਮੀਕਰਨ ਕੈਸੇਟ ਦੇ ਦੂਜੀ ਪੀੜ੍ਹੀ ਦੇ ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਲ ਸਮੀਕਰਨ ਵੈਕਟਰ ਅੱਪਸਟ੍ਰੀਮ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ HEK293T ਸੈੱਲਾਂ [ਅਮਰੀਕਨ ਟਾਈਪ ਕਲਚਰ ਕਲੈਕਸ਼ਨ (ATCC)] ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ; ਡੁਲਬੇਕੋ ਦੇ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਈਗਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਉਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 10% ਭਰੂਣ ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ (FBS) ਅਤੇ 1% ਪੇਨਸਟ੍ਰੈਪ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ CAR-GFP ਵੈਕਟਰ ਅਤੇ ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ (psPAX2 ਅਤੇ pMD2.G, ਐਡਜੀਨ) ਲਿਪੋਫੈਕਸ਼ਨ ਅਮੀਨ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਵਾਇਰਸ-ਯੁਕਤ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 48 ਅਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਅਲਟਰਾਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਤੱਕ -80°C 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਵਾਇਰਲ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਸਟੋਰ ਕਰੋ।
PBMC ਨੂੰ ਫਿਕੋਲ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਡੈਨਸਿਟੀ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਸਿਹਤਮੰਦ ਦਾਨੀ ਲਿਊਕੋਸਾਈਟ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ (STEMCELL ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। PBMC ਤੋਂ CD8+ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਚੋਣ CD8 ਮਾਈਕ੍ਰੋਬੀਡਜ਼ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਟ੍ਰਾਂਸਐਕਟ (ਮਿਲਟੇਨੀ) ਨਾਲ ਅਤੇ ਟੈਕਸਮੈਕਸ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰੋ [ਮਿਲਟੇਨੀ; 3% ਗਰਮੀ-ਨਿਰੰਤਰ ਮਨੁੱਖੀ ਸੀਰਮ, 1% ਪੇਨਸਟ੍ਰੈਪ ਅਤੇ IL-2 (300 U/ml) ਨਾਲ ਪੂਰਕ]। ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਚੌਵੀ ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ, ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ (ਪ੍ਰਤੀ 106 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ 10 μl ਸੰਘਣਾ ਵਾਇਰਸ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ) ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਾਈਟੇਕ ਔਰੋਰਾ (FSC (ਫਾਰਵਰਡ ਸਕੈਟਰ)/SSC (ਸਾਈਡ ਸਕੈਟਰ), ਸਿੰਗਲਟ, GFP+ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਤੋਂ 1 ਤੋਂ 3 ਦਿਨ ਬਾਅਦ), ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 30% ਦੀ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ GFP ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰੋ।
CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇਮਯੂਨੋਕਲਟ (STEMCELL ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ; 1% PenStrep ਨਾਲ ਪੂਰਕ) ਵਿੱਚ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕਲਚਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਹਨਾਂ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ: ਬਿਨਾਂ ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ, 250 μM ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਜਾਂ 10 mM MNA ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਪ੍ਰੀ-ਟਰੀਟਮੈਂਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, CAR-T ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 20,000 SK-OV-3 ਸੈੱਲਾਂ [ATCC; McCoy 5A ਮਾਧਿਅਮ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਵਿੱਚ 10% FBS ਅਤੇ 1% PenStrep ਨਾਲ ਪੂਰਕ 10 'ਤੇ: 1 ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਕ ਤੋਂ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਇਮਯੂਨੋਕਲਟ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਿਪਲੀਕੇਟ ਵਿੱਚ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਡਿਜੀਟਲਿਸ ਸੈਪੋਨਿਨ (0.5mg/ml; ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨਾਲ ਲਾਈਸ ਕੀਤੇ SK-OV-3 ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ SK-OV-3 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਅਤੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। 24 ਘੰਟਿਆਂ ਦੀ ਸਹਿ-ਖੇਤੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਲੈਕਟੇਟ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਸ (LDH) ਨੂੰ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) ਅਨੁਸਾਰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। LDH ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ LDH ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1:50 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਤਲ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ: ਕਤਲ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ = ਸੁਧਾਰ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ / ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਤਲ ਦਰ x 100%, ਜਿੱਥੇ ਸੁਧਾਰ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ = ਸਿਰਫ਼ ਸਹਿ-ਸੱਭਿਆਚਾਰ-ਟੀ ਸੈੱਲ, ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਤਲ ਦਰ = ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ-ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟੈਕਸਟ ਜਾਂ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 8, ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਾਫਟ ਐਕਸਲ ਜਾਂ ਆਰ v3.6.0 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਜੇਕਰ ਇੱਕੋ ਮਰੀਜ਼ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਸਾਈਟਸ ਅਤੇ ਟਿਊਮਰ) ਤੋਂ ਕਈ ਨਮੂਨੇ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਾਂ ਮਰੀਜ਼ ਨੂੰ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਜਾਂ ਆਮ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਜੋਂ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਚਿਤ ਹੋਵੇ। ਮੈਟਾਬੋਲੌਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਮਹੱਤਵ ਟੈਸਟ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਲੇਖ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ਵੇਖੋ।
ਇਹ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਪਹੁੰਚ ਵਾਲਾ ਲੇਖ ਹੈ ਜੋ ਕਰੀਏਟਿਵ ਕਾਮਨਜ਼ ਐਟ੍ਰਬਿਊਸ਼ਨ-ਗੈਰ-ਵਪਾਰਕ ਲਾਇਸੈਂਸ ਦੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਧੀਨ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿਸੇ ਵੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਵਰਤੋਂ, ਵੰਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਅੰਤਿਮ ਵਰਤੋਂ ਵਪਾਰਕ ਲਾਭ ਲਈ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਆਧਾਰ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ ਕੰਮ ਸਹੀ ਹੈ। ਹਵਾਲਾ।
ਨੋਟ: ਅਸੀਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਆਪਣਾ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਦੇਣ ਲਈ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ ਤਾਂ ਜੋ ਜਿਸ ਵਿਅਕਤੀ ਨੂੰ ਤੁਸੀਂ ਪੰਨੇ 'ਤੇ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹੋ ਉਸਨੂੰ ਪਤਾ ਲੱਗੇ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ ਕਿ ਉਹ ਈਮੇਲ ਦੇਖੇ ਅਤੇ ਇਹ ਸਪੈਮ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕੋਈ ਵੀ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕਰਾਂਗੇ।
ਇਹ ਸਵਾਲ ਇਹ ਜਾਂਚਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਵਿਜ਼ਟਰ ਹੋ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸਪੈਮ ਸਬਮਿਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ।
ਮਾਰੀਸਾ ਕੇ. ਕਿਲਗੌਰ (ਮਾਰੀਸਾ ਕੇ. ਕਿਲਗੌਰ), ਸਾਰਾਹ ਮੈਕਫਰਸਨ (ਸਾਰਾਹ ਮੈਕਫਰਸਨ), ਲੌਰੇਨ ਜੀ. ਜ਼ੈਕਰਿਆਸ (ਲੌਰੇਨ ਜੀ. ਜ਼ੈਕਰਿਆਸ), ਅਬੀਗੈਲ ਏਲੀ ਏਰਿਸ ਜੀ. ਵਾਟਸਨ (ਐਚ. ਵਾਟਸਨ), ਜੌਨ ਸਟੈਗ (ਜੌਨ ਸਟੈਗ), ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਨੇਲਸਨ (ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਐਨ. ਬੇਲਨ), ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਐਨ. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russel G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਇਮਿਊਨ ਦਮਨ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਇਮਯੂਨੋਥੈਰੇਪੀ ਟੀਚੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਮਾਰੀਸਾ ਕੇ. ਕਿਲਗੌਰ (ਮਾਰੀਸਾ ਕੇ. ਕਿਲਗੌਰ), ਸਾਰਾਹ ਮੈਕਫਰਸਨ (ਸਾਰਾਹ ਮੈਕਫਰਸਨ), ਲੌਰੇਨ ਜੀ. ਜ਼ੈਕਰਿਆਸ (ਲੌਰੇਨ ਜੀ. ਜ਼ੈਕਰਿਆਸ), ਅਬੀਗੈਲ ਏਲੀ ਏਰਿਸ ਜੀ. ਵਾਟਸਨ (ਐਚ. ਵਾਟਸਨ), ਜੌਨ ਸਟੈਗ (ਜੌਨ ਸਟੈਗ), ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਨੇਲਸਨ (ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਐਨ. ਬੇਲਨ), ਬ੍ਰੈਡ ਐਚ. ਐਨ. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russel G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ਟੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਇਮਿਊਨ ਦਮਨ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕੈਂਸਰ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਇਮਯੂਨੋਥੈਰੇਪੀ ਟੀਚੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
©2021 ਅਮੈਰੀਕਨ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਫਾਰ ਦ ਐਡਵਾਂਸਮੈਂਟ ਆਫ਼ ਸਾਇੰਸ। ਸਾਰੇ ਹੱਕ ਰਾਖਵੇਂ ਹਨ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ਅਤੇ COUNTER ਦਾ ਭਾਈਵਾਲ ਹੈ। ਸਾਇੰਸ ਐਡਵਾਂਸ ISSN 2375-2548।