Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਧੰਨਵਾਦ। ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਜਾ ਰਹੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਿੱਚ CSS ਲਈ ਸੀਮਤ ਸਮਰਥਨ ਹੈ। ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤੇ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਬੰਦ ਕਰੋ)। ਇਸ ਦੌਰਾਨ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਹਾਇਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ ਜਾਵਾ ਸਕ੍ਰਿਪਟ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਾਂਗੇ।
ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਵਾਲੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਉਲਟ, ਕੀੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਰ-ਪੱਖਪਾਤੀ ਸੈਕਸ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਦੀ ਘਾਟ ਬਾਰੇ ਸੋਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਗੈਂਬੀਆ ਵਿੱਚ, ਇਕਡੀਸੋਨ ਸਟੀਰੌਇਡ 20-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਕਡੀਸੋਨ (20E) ਮਾਦਾ 2 ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਹੋਣ 'ਤੇ ਅੰਡੇ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਨਰ 3 ਦੁਆਰਾ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਇੱਕ ਮੇਲ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਪੀਰੀਅਡ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਕਸਤ ਹੋਇਆ ਜਾਪਦਾ ਹੈ। ਕਿਉਂਕਿ ਅੰਡੇ ਦਾ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਮੇਲ ਜ਼ਰੂਰੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਗੁਣ ਹਨ, ਇਸ ਲਈ ਇਹ ਸਮਝਣਾ ਕਿ ਮਾਦਾ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਮੱਛਰ ਇਹਨਾਂ ਹਾਰਮੋਨਲ ਸਿਗਨਲਾਂ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਨਵੇਂ ਮਲੇਰੀਆ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਾਂ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਨੂੰ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਖੁਲਾਸਾ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਹ ਪ੍ਰਜਨਨ ਕਾਰਜ ਇਕਡੀਸੋਰੋਇਡ-ਐਕਟੀਵੇਟਿੰਗ/ਇਨਐਕਟੀਵੇਟਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਨੈਟਵਰਕ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖਰੇ ਸੈਕਸ ਸਟੀਰੌਇਡ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਇਕਡੀਸੋਨ, 3-ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋ-20E (3D20E) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਡੀਫੋਸਫੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਜਿਨਸੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਅਤੇ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਾਦਾ ਜਿਨਸੀ ਗ੍ਰਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆਂ ਦੀ ਰੱਖਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, 3D20E ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਨੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜੋ ਪਲਾਜ਼ਮੋਡੀਅਮ ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ ਅੰਡੇ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਦੇ ਹਨ, ਸੰਕਰਮਿਤ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੀ ਸਿਹਤ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਮਾਦਾ-ਪ੍ਰਾਪਤ 20E ਇਹ ਜਿਨਸੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਪੈਦਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ, ਪਰ 20E-ਇਨਿਹਿਬਿਟਿੰਗ ਕਾਇਨੇਸ ਦੇ ਰੋਕਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਵਿਅਕਤੀਆਂ ਨੂੰ ਅੰਡੇ ਦੇਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕੀਟ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਦੀ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਮਾਦਾ ਜਿਨਸੀ ਗ੍ਰਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ, ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਅਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮੋਡੀਅਮ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਨਿਯਮਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਮਲੇਰੀਆ ਫੈਲਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮੱਛਰਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਸਫਲਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।
ਮਨੁੱਖੀ ਮਲੇਰੀਆ ਪਰਜੀਵੀਆਂ ਦੇ ਇਕਲੌਤੇ ਵੈਕਟਰ, ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਮੱਛਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਕੀਟਨਾਸ਼ਕ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਦੇ ਕਾਰਨ ਮਲੇਰੀਆ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਅਤੇ ਮੌਤਾਂ ਫਿਰ ਤੋਂ ਵੱਧ ਰਹੀਆਂ ਹਨ। ਇਨ੍ਹਾਂ ਮੱਛਰਾਂ ਦਾ ਮੇਲ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਨਵੇਂ ਮਲੇਰੀਆ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਲਈ ਇੱਕ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਕਰਸ਼ਕ ਟੀਚਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਮਾਦਾਵਾਂ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਵਾਰ ਮੇਲ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ5; ਇਸ ਸਿੰਗਲ ਮੇਲ ਘਟਨਾ ਨੂੰ ਨਿਰਜੀਵ ਬਣਾਉਣ ਨਾਲ ਖੇਤ ਵਿੱਚ ਮੱਛਰਾਂ ਦੀ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਦੀ ਬਹੁਤ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੋਵੇਗੀ।
ਔਰਤਾਂ ਮਰਦਾਂ ਤੋਂ ਹਾਈ-ਟਾਈਟਰ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਸਮਰੱਥ ਹੋ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ। ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਅੱਗੇ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮੁਸ਼ਕਲ ਦਾ ਕਾਰਨ 20-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਕਡਾਈਸੋਨ (20E) ਹੈ, ਇੱਕ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਜਿਸਨੂੰ ਲਾਰਵਾ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਪਿਘਲਣ ਚੱਕਰ ਦੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰ ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। 20E ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਨ ਦੀ ਮਰਦਾਂ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵਿਕਸਤ ਹੋਈ ਹੈ ਜੋ ਉਪਜੀਨਸ ਸੈਲੀਆ7 ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਅਫਰੀਕਾ ਵਿੱਚ ਵੰਡੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਮਲੇਰੀਆ ਦੇ ਸਭ ਤੋਂ ਖਤਰਨਾਕ ਵੈਕਟਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਗੈਂਬੀਆ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ। ਇਹ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਮਾਦਾਵਾਂ ਹਰ ਖੂਨ ਦੇ ਭੋਜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 20E ਵੀ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ 20E ਓਜੇਨੇਸਿਸ ਚੱਕਰ ਨੂੰ ਚਲਾਉਂਦਾ ਹੈ (ਰੈਫ. 8 ਵੇਖੋ)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮਾਦਾਵਾਂ ਆਪਣੀ ਮੇਲ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨਾਲ ਸਮਝੌਤਾ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਇੱਕਡੀਸੋਨ (ਮਰਦ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਅਤੇ ਖੂਨ ਖੁਆਉਣਾ ਇੰਡਕਸ਼ਨ) ਦੇ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਰੋਤਾਂ ਤੋਂ ਸਿਗਨਲਾਂ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਜੋੜਦੀਆਂ ਹਨ। ਦਰਅਸਲ, ਜੇਕਰ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ 20E ਜਿਨਸੀ ਅਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਕੁਆਰੀਆਂ-ਖੁਆਉਣ ਵਾਲੇ ਵਿਅਕਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਬਾਂਝਪਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗਾ, ਇਹਨਾਂ ਮੱਛਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਆਮ ਵਿਵਹਾਰ।
ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਵਿਆਖਿਆ ਇਹ ਹੈ ਕਿ A. gambiae ਨਰ ਇੱਕ ਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ecdysone ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਮਾਦਾ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟ੍ਰੈਕਟ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਕੈਸਕੇਡ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮੇਲ ਅਸਥਿਰਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਵਾਲੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕਈ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਸਟ੍ਰੋਜਨ ਅਤੇ ਐਂਡਰੋਜਨ (ਰੈਫ. 9 ਵਿੱਚ ਸਮੀਖਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ), ਸਾਡੇ ਗਿਆਨ ਅਨੁਸਾਰ, ਕੀੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਐਂਡਰੋਜਨਿਕ-ਪੱਖੀ ਸਟੀਰੌਇਡ ਦੀ ਪਛਾਣ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਸੰਭਾਵਿਤ ਸੋਧਣ ਵਾਲੇ ਸਟੀਰੌਇਡਜ਼ ਦੀ ਭਾਲ ਵਿੱਚ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਿਪੱਕ A. gambiae ਦੇ ਨਰ ਪੁਰਸ਼ ਸਹਾਇਕ ਗ੍ਰੰਥੀ (MAG) ਵਿੱਚ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨਸ ਦੇ ਭੰਡਾਰ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਕਲੇ। ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਤੇ ਗਏ ਘੱਟ ਖਾਸ ਢੰਗ ਦੀ ਬਜਾਏ ਟੈਂਡਮ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (HPLC-MS/MS) ਦੇ ਨਾਲ ਉੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਟਿਸ਼ੂ ਵਿੱਚ ecdysone (E) ਅਤੇ 20E ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ, ਜੋ ਪਿਛਲੇ ਨਤੀਜੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ ਸਟੀਰੌਇਡਜ਼ ਦਾ ਦਬਦਬਾ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਫਾਰਮੂਲਾ 3-ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋ-20E-22-ਫਾਸਫੇਟ (3D20E22P)12 (ਚਿੱਤਰ 1) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੀ। ਹੋਰ ਰੂਪਾਂ ਵਿੱਚ 3-ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋ-20E (3D20E) ਅਤੇ 20E-22-ਫਾਸਫੇਟ (20E22P) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। 3D20E22P ਦੀ HPLC-MS/MS ਸਿਗਨਲ ਤੀਬਰਤਾ ਇਸਦੇ ਡੀਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ ਰੂਪ, 3D20E ਨਾਲੋਂ ਦੋ ਆਰਡਰ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ, ਅਤੇ E ਅਤੇ 20E ਨਾਲੋਂ ਤਿੰਨ ਆਰਡਰ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 1). ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਰੀਰ ਦੇ ਹੋਰ ਹਿੱਸਿਆਂ ਅਤੇ ਹੇਠਲੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟ੍ਰੈਕਟ ਵਿੱਚ (LRT; ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1a)। ਅਸੀਂ ਨਵੇਂ ਬੰਦ (<1 ਦਿਨ ਪੁਰਾਣੇ) ਮਰਦਾਂ ਅਤੇ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ecdysteroids ਦਾ ਵੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਅਤੇ ਸਿਰਫ਼ MAG ਵਿੱਚ 3D20E ਅਤੇ 3D20E22P ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ; E, 20E ਅਤੇ 20E22P ਦੋਵਾਂ ਲਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1b)। ਇਹ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ A. gambiae ਬਾਲਗ ਨਰ ਆਪਣੇ MAGs ਵਿੱਚ ਸੋਧਣ ਵਾਲੇ ਹਾਰਮੋਨਾਂ ਦੇ ਉੱਚ ਟਾਈਟਰਸ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਔਰਤਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
MAG ਅਤੇ ਮਾਦਾ LRT (ਐਟ੍ਰੀਆ, ਸੈਮੀਨਲ ਵੇਸਿਕਲ, ਅਤੇ ਪੈਰੋਵੇਰੀਅਮ ਸਮੇਤ) ਨੂੰ 4-ਦਿਨ-ਪੁਰਾਣੇ (4-ਦਿਨ-ਪੁਰਾਣੇ) ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਅਤੇ ਕੁਆਰੀਆਂ ਅਤੇ ਮੇਲ ਵਾਲੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ (0.5, 3, ਅਤੇ 12 hpm) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹਨਾਂ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ Ecdysone ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ HPLC-MS/MS (ਔਸਤ ± sem; ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ, ਗਲਤ ਖੋਜ ਦਰ (FDR) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; NS, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 0.5 ਘੰਟੇ, P = 0.035; 12 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 3 ਘੰਟੇ, P = 0.0015; 12 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 0.5 ਘੰਟੇ, P = 0.030. 3D20E22P: 3 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 0.5 ਘੰਟੇ, P = 0.25; 12 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 3 ਘੰਟੇ, P = 0.0032; 12 ਘੰਟੇ ਬਨਾਮ 0.5 ਘੰਟੇ, P = 0.015)। ਡੇਟਾ ਤਿੰਨ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ ਹੈ। ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੇ ਹਰੇਕ ਇਕਡੀਸੋਨ ਲਈ ਸਿਖਰ ਖੇਤਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਮੱਛਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦੁਆਰਾ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਕਡੀਸੋਨ ਨੂੰ ਰੰਗ ਦੁਆਰਾ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ: E, ਹਰਾ; 20E, ਸੰਤਰੀ; 20E22P, ਜਾਮਨੀ; 3D20E, ਨੀਲਾ; 3D20E22P, ਗੁਲਾਬੀ। ਇਨਸੈੱਟ ਘੱਟ ਇਕਡੀਸੋਨ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ y-ਧੁਰੇ 'ਤੇ ਪੈਮਾਨੇ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ 3D20E22P ਅਤੇ 3D20E ਮੇਲਣ ਦੌਰਾਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਮਾਦਾ LRTs ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਕੁਆਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ecdysone ਨਹੀਂ ਮਿਲਿਆ, ਅਸੀਂ ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਬਾਅਦ LRT ਵਿੱਚ 3D20E22P ਦੀ ਕਾਫ਼ੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇਖੀ (ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 0.5 ਘੰਟੇ, hpm), ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਘਟਦੀ ਗਈ, ਜਦੋਂ ਕਿ 3D20E ਦੇ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ (ਚਿੱਤਰ 1)। ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ 3D20E ਨੂੰ ਇੱਕ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ ਮੇਲਣ LRTs ਵਿੱਚ ਇਸ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਦੇ ਪੱਧਰ 20E ਨਾਲੋਂ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 100 ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 1)। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, 3D20E22P ਮੁੱਖ ਨਰ ecdysone ਹੈ ਜੋ ਮੇਲਣ ਦੌਰਾਨ ਮਾਦਾ LRT ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਡੀਫੋਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ ਰੂਪ, 3D20E, ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਥੋੜ੍ਹੀ ਦੇਰ ਬਾਅਦ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਮਾਦਾ ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ ecdysone ਲਈ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
ਇੱਕ ਨਵਾਂ RNA ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ (RNA-seq) ਡੇਟਾਸੈਟ (ਚਿੱਤਰ 2a) ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇੱਕ ਕਸਟਮ-ਬਿਲਟ ਬਾਇਓਇਨਫਾਰਮੈਟਿਕਸ ਪਾਈਪਲਾਈਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ਅਤੇ ecdysone 20E-modified phosphatase gene ਨੂੰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਕਰਨ ਦੀ ਖੋਜ ਕੀਤੀ।EPP) ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਉਮੀਦਵਾਰ EPP ਜੀਨ ਅਤੇ ਦੋ ਸੰਭਾਵੀ EcK ਜੀਨਾਂ (EcK1 ਅਤੇ EcK2) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਪਰ ਇੱਕ ਚੰਗਾ ਉਮੀਦਵਾਰ EO ਜੀਨ ਲੱਭਣ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਰਹੇ।ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਵਿਅਕਤੀਗਤ EPP ਜੀਨ ਗੈਂਬੀਅਨ MAGs ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ (98.9ਵੇਂ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ) 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਪਰ ਮਾਦਾ LRTs (ਚਿੱਤਰ 2b) ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ, ਸਾਡੀਆਂ ਉਮੀਦਾਂ ਦੇ ਉਲਟ ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਮਾਦਾ ਟਿਸ਼ੂ ਵਿੱਚ 3D20E22P ਦਾ ਡੀਫੋਸਫੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਹੋਇਆ ਸੀ।ਇਸ ਲਈ, ਸਾਡਾ ਮੰਨਣਾ ਹੈ ਕਿ ਮਰਦ EPP ਮੇਲ ਦੌਰਾਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਦਰਅਸਲ, ਅਸੀਂ ਮੇਲ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਾਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਮਾਸਕ ਕਰਨ ਲਈ ਇਨ ਵਿਵੋ ਸਟੇਬਲ ਆਈਸੋਟੋਪ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਮਾਦਾ ਐਟ੍ਰੀਅਮ ਵਿੱਚ MS ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਇੱਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (ਚਿੱਤਰ 2c ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ)। 1). MAG ਅਤੇ ਮੇਲਿਤ (ਪਰ ਕੁਆਰੀ ਨਹੀਂ) ਮਾਦਾ LRT ਵਿੱਚ EPP ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਵੀ ਖਾਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (ਚਿੱਤਰ 2d) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
a, EcKs, EOs, ਅਤੇ EPPs ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਹਰੇਕ ਲਿੰਗ ਦੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕਸਟਮ-ਬਿਲਟ ਬਾਇਓਇਨਫਾਰਮੈਟਿਕਸ ਪਾਈਪਲਾਈਨ। ਤੀਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਵਾਲੇ ਨੰਬਰ ਹਰੇਕ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਮਰਦ ਅਤੇ ਮਾਦਾ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਇੱਕ EPP ਜੀਨ (EPP) ਅਤੇ ਇੱਕ EcK ਜੀਨ (EcK1) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜੋ ਮਰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇੱਕ EcK ਜੀਨ (EcK2) ਜੋ ਦੋਵਾਂ ਲਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਪਰ ਇੱਕ ਉਮੀਦਵਾਰ EO ਜੀਨ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦਾ।b, ਹੀਟਮੈਪ ਕੁਆਰੀ (V) ਅਤੇ ਮੇਲ (M) ਐਨੋਫਿਲਿਸ ਗੈਂਬੀਆ ਅਤੇ ਐਨੋਫਿਲਿਸ ਐਲਬਿਕਨਸ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਉਮੀਦਵਾਰ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।Spca, ਗਰੱਭਧਾਰਣ; MAGs, ਮਰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਕ ਗ੍ਰੰਥੀਆਂ; ਸਰੀਰ ਦੇ ਹੋਰ ਹਿੱਸੇ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਛਾਤੀਆਂ, ਖੰਭਾਂ, ਲੱਤਾਂ, ਚਰਬੀ ਵਾਲੇ ਸਰੀਰ, ਅਤੇ ਦੋਵਾਂ ਲਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਅੰਗ, ਅਤੇ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। EcK2 ਗੈਂਬੀਆ ਦੇ MAG ਅਤੇ atria ਦੋਵਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ EPP ਸਿਰਫ਼ MAG ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।c, 3, 12 ਅਤੇ 24 hpm 'ਤੇ ਮਾਦਾ atria ਵਿੱਚ ਨਰ ejaculate ਸਮੂਹ ਟ੍ਰਾਂਸਲੋਕੇਸ਼ਨ ਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, 67 ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਭਰਪੂਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਲੇਬਲ (ਅਤੇ ਮਾਸਕ) ਕਰਨ ਲਈ ਔਰਤਾਂ ਨੂੰ 15N ਵਾਲੀ ਖੁਰਾਕ 'ਤੇ ਪਾਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਟੈਗ ਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਰਦਾਂ ਨੂੰ ਟੈਗ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਮਾਦਾ LRTs ਨੂੰ 3, 12 ਅਤੇ 24 hpm 'ਤੇ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ejaculatory ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪੂਰੀ ਸੂਚੀ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1 ਵੇਖੋ)। ਇਹਨਾਂ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਦੇ MAG ਵਿੱਚ ਇਨਸੈੱਟ, EPP, Eck1 ਅਤੇ EcK2 ਦਾ ਪਤਾ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਦੇ MAG ਅਤੇ LRT ਵਿੱਚ ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟ ਦੁਆਰਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ ਕੁਆਰੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਜਾਂ ਮਰਦਾਂ ਜਾਂ ਬਾਕੀ ਮਾਦਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ। ਸਰੀਰ। ਝਿੱਲੀਆਂ ਦੀ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਐਂਟੀ-ਐਕਟਿਨ (ਲੋਡਿੰਗ ਕੰਟਰੋਲ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਈਪੀਪੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਸਾਰੇ ਮਰਦ ਕੁਆਰੇ ਹਨ। ਜੈੱਲ ਸਰੋਤ ਡੇਟਾ ਲਈ ਪੂਰਕ ਚਿੱਤਰ 1 ਵੇਖੋ। ਪੱਛਮੀ ਬਲੌਟਸ ਦੋ ਵਾਰ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
EPP ਦੀ ecdysteroid phosphophosphatase ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ HPLC-MS/MS ਦੁਆਰਾ MAG ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ 3D20E22P ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 2a)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ RNA-ਮੱਧਮ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ (RNAi) ਦੁਆਰਾ EPP ਨੂੰ ਚੁੱਪ ਕਰਵਾਇਆ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਮਰਦਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਕਮੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ (ਚਿੱਤਰ 3a), ਅਤੇ EPP-ਮੁੱਢਲੇ ਪੁਰਸ਼ਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਨੇ ਅੰਸ਼ਕ ਜੀਨ ਚੁੱਪ ਹੋਣ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਡੀਫੋਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ 3D20E (ਚਿੱਤਰ 3b) ਦਾ ਘੱਟ ਅਨੁਪਾਤ ਦਿਖਾਇਆ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 2b,c)। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, ਅਸੀਂ ਉਸੇ ਮੱਛਰਾਂ ਵਿੱਚ 20E22P/20E ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਨਜ਼ਾਈਮ 3D20E22P (ਚਿੱਤਰ 3b) ਲਈ ਖਾਸ ਹੈ।
a, ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ EPP RNA (dsEPP) ਜਾਂ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ GFP RNA (dsGFP) ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ EPP ਨੂੰ ਚੁੱਪ ਕਰਾਉਣ ਕਾਰਨ MAG ਵਿੱਚ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਘਟੀ। ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ (P = 0.0046, ਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) ਵਿੱਚ ਵੀਹ MAG ਪੂਲ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜੋ ਵੱਖਰੇ ਬਿੰਦੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਸਨ। b, EPP-ਸਾਈਲੈਂਸਡ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ 3 hpm (P = 0.0043, ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) 'ਤੇ ਡੀਫੋਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ 3D20E ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ 20E ਪੱਧਰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਏ (P = 0.063, ਅਨਪੇਅਰਡ)। ਟੀ-ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ)। 13, 16 ਅਤੇ 19 ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੇ ਤਿੰਨ ਪੂਲਾਂ ਤੋਂ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± ਸੈਮ ਵਜੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। c, EPP-ਚੁੱਪ ਕੀਤੇ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਮੇਲ ਕਰਨ ਦੀ ਦਰ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ (P = 0.0002, ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ)। ਔਰਤਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮੇਲਣ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮੇਲ ਕਰਨ ਲਈ ਮਜਬੂਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; 2 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਜੀਨ ਦੇ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਦੁਆਰਾ ਮੁੜ-ਮੇਲ ਦਰਾਂ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਟ੍ਰਾਂਸਜੈਨਿਕ ਸ਼ੁਕਰਾਣੂ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਦੂਜੇ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਸੰਪਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਡੀ, ਈਪੀਪੀ-ਚੁੱਪ ਕੀਤੇ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਖੂਨ-ਖੁਆਉਣ ਵਾਲੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੇ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਸੀ (ਪੀ < 0.0001; ਮੈਨ-ਵਿਟਨੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) ਅਤੇ ਥੋੜ੍ਹਾ ਜਿਹਾ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅੰਡੇ ਦੀ ਗਿਣਤੀ (ਪੀ = 0.088, ਮੈਨ-ਵਿਟਨੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) , ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਪੌਨਿੰਗ ਦਰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਈ ਸੀ (ਪੀ = 0.94, ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ)। ਸਾਰੇ ਪੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ, n ਜੈਵਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਮੱਛਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। NS, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ।*ਪੀ < 0.05, **ਪੀ < 0.01, ***ਪੀ < 0.001, ****ਪੀ < 0.001।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕੀ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਮੇਲਣ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ecdysone dephosphorylation ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, EPP-ਘੱਟ ਹੋਏ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਵਾਧੂ (ਟ੍ਰਾਂਸਜੈਨਿਕ) ਮਰਦਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3c) ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਣ 'ਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਮਾਦਾਵਾਂ (10.4%) ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ (44.9%) 'ਤੇ ਦੁਬਾਰਾ ਮੇਲ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ (ਚਿੱਤਰ 3d, ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਇਹਨਾਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਅੰਡਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਕਮੀ (ਚਿੱਤਰ 3d, ਵਿਚਕਾਰ) ਵੀ ਦੇਖੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਅੰਡਿਆਂ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ (ਮੇਲਣ ਦੁਆਰਾ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਇੱਕ ਹੋਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ) ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਈ (ਚਿੱਤਰ 3d, ਸੱਜੇ)। 3D20E22P ਲਈ EPP ਦੀ ਦੇਖੀ ਗਈ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਮੇਲਣ ਦੌਰਾਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤੇ ਗਏ EPP ਦੁਆਰਾ 3D20E ਦੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਹੋਰ ਮੇਲਣ ਲਈ ਮਾਦਾ ਗ੍ਰਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਵਿਵਹਾਰ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ 20E ਦੇ ਜਿਨਸੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਸੀ। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹਾਰਮੋਨ ਮਾਦਾ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਨੂੰ ਵੀ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ 3D20E (ਚਿੱਤਰ 4a–c) ਅਤੇ ਵਪਾਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ 20E ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਿਪੱਕ ਕੁਆਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ 20E ਅਤੇ 3D20E ਦੀਆਂ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ 3D20E ਦੋਵਾਂ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4d) 'ਤੇ ਮੇਲਣ ਪ੍ਰਤੀ ਮਾਦਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਨ ਵਿੱਚ 20E ਨਾਲੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, LRT ਵਿੱਚ 3D20E ਦੇ ਅੱਧੇ ਸਰੀਰਕ ਪੱਧਰ (1,066 pg ਪੋਸਟ-ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਬਨਾਮ 2,022 pg ਪੋਸਟ-ਮਿਟਿੰਗ) ਨੇ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜੋ 24 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ 20E (361 pg ਪੋਸਟ-ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ) ਦੇ ਸਰੀਰਕ ਪੱਧਰ ਨਾਲੋਂ 20 ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਸੀ। ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 18 pg ਪੋਸਟ-ਮਿਟਿੰਗ 'ਤੇ; ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 1)। ਇਹ ਨਤੀਜਾ ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ 20E ਦਾ ਜਿਨਸੀ ਤਬਾਦਲਾ ਮੇਲ-ਜੋਲ ਦੇ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਪੀਰੀਅਡ ਦਾ ਕਾਰਨ ਨਹੀਂ ਬਣਦਾ, ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਮਾਤਾ-ਪਿਤਾ-ਬੱਚੇ ਦੇ ਰਿਸ਼ਤੇ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਕਾਰਕ ਵਜੋਂ 3D20E ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4e) ਵਿੱਚ ਅੰਡੇ ਦੇਣ ਦੇ ਟੈਸਟਾਂ ਵਿੱਚ 3D20E 20E ਨਾਲੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਰਗਰਮ ਸੀ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਅੰਸ਼ਕ EPP ਚੁੱਪ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਅਸੀਂ ਜੋ ਆਮ ਅੰਡੇ ਦੇਣ ਦੀ ਦਰ ਦੇਖੀ ਸੀ ਉਹ ਅਜੇ ਵੀ ਮੇਲ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਮਾਦਾ ਕਾਰਕਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਬਾਕੀ 3D20E ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਸੀ।
(a,b) 3D20E ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ 20E (a) ਤੋਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਬਹੁਤ ਉੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ/ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੇ ਨਾਲ (ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਤੋਂ ਔਸਤ ± sem ਵਜੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਡੇਟਾ) (b).c, ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ (ਹੇਠਲਾ ਅੱਧਾ) ਮੇਲ ਕੀਤੀ ਮਾਦਾ LRT (ਉੱਪਰਲਾ ਅੱਧਾ) ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ecdysone ਨਾਲ ਬਿਲਕੁਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ।d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) ਅਤੇ 10% ਈਥੇਨੌਲ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, 2-ਪਾਸੜ) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, ਜਦੋਂ ਕਿ 20E ਸਿਰਫ ਉੱਚ ਖੁਰਾਕਾਂ 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਾਲੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, 2-ਪਾਸੜ).e, 3D20E ਟੀਕੇ ਨੇ 10% ਈਥੇਨੌਲ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) ਨਾਲੋਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਸਪੌਨਿੰਗ ਦਰਾਂ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ 20E ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਸਿਰਫ਼ ਉੱਚ ਖੁਰਾਕਾਂ 'ਤੇ (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ)।3D20E ਨੇ ਉੱਚ ਖੁਰਾਕਾਂ (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਦੋ-ਪਾਸੜ) 'ਤੇ 20E ਨਾਲੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਪੌਨਿੰਗ ਦਰਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ। ਸਾਰੇ ਪੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ, n ਜੈਵਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਮੱਛਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। NS, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001। ਡੇਟਾ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ ਹੈ।
ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਕਿ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨਾਂ ਦਾ ਜਿਨਸੀ ਤਬਾਦਲਾ MISO (Mating-Indused Stimulator of Oogenesis 11) ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਮਾਦਾ ਪ੍ਰਜਨਨ ਜੀਨ ਜੋ A. gambiae ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ P. falciparum ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਿਹਤ ਖਰਚੇ 13 ਦੁਆਰਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਸਭ ਤੋਂ ਘਾਤਕ ਮਨੁੱਖੀ ਮਲੇਰੀਆ ਪਰਜੀਵੀ ਹੈ। ਮਲੇਰੀਆ-ਸਥਾਈ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਦੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਤੰਦਰੁਸਤੀ ਲਈ MISO ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕਿਹੜਾ ਹਾਰਮੋਨ 3D20E ਜਾਂ 20E ਇਸ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਜਦੋਂ ਕਿ 20E ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਾਂ ਵਧੇਰੇ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੁਝ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਹਾਰਮੋਨ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ (HR), ਜਿਵੇਂ ਕਿ HR3 ਅਤੇ HR4, ਅਤੇ ਖਾਸ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਸਟੀਰੌਇਡ ਟੀਚਿਆਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਯੋਲਕੋਜੇਨਿਕ ਜੀਨ Vg14, 15, 16, MISO ਨੂੰ 3D20E (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 3) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਸ ਐਂਡਰੋਜਨਿਕ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਦਾ ਜਿਨਸੀ ਤਬਾਦਲਾ ਉਹਨਾਂ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਪ੍ਰਤੀਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਪਰਜੀਵੀ ਲਾਗ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਖਰਚਿਆਂ ਤੋਂ ਔਰਤਾਂ ਦੀ ਰੱਖਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, 3D20E ਇਹ E ਰੀਸੈਪਟਰ EcR ਦੇ ਦੋਵਾਂ ਆਈਸੋਫਾਰਮਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, EcR-A ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ EcR-B ਨੂੰ ਦਬਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ HPX15 ਸਮੇਤ ਹੋਰ ਮੇਲ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਦਾ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇਹ EPP-ਚੁੱਪ ਕੀਤੇ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਾਂਝਪਨ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 3)। ਇਹ ਡੇਟਾ ਦੋ ecdysone ਹਾਰਮੋਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਲਿੰਗ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਅੰਡਰਲਾਈੰਗ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਆਪਣੀ ਬਾਇਓਇਨਫਾਰਮੈਟਿਕਸ ਪਾਈਪਲਾਈਨ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਦੋ EcK ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਕਾਰਜ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। EcK1 ਜਾਂ EcK2 ਨੂੰ ਚੁੱਪ ਕਰਨ ਨਾਲ ਮਰਦਾਂ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੌਤ ਦਰ ਹੋਈ (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 4a), ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ecdysone ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਸ਼ਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ, ਬਚਾਅ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ। ਕਿਉਂਕਿ EcK2 ਨੂੰ EcK1 ਨਾਲੋਂ ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ 'ਤੇ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਦੁਆਰਾ MAGs ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2b,c ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2), ਅਸੀਂ ਇਸਦੀ ecdysteroid kinase ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ 20E ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਸ਼ਨ 20E22P (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 2).4b) ਹੋਇਆ। 3D20E ਨੂੰ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਸਮੇਂ, ਅਸੀਂ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ ਉਤਪਾਦ 3D20E22P (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 4c) ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਸੀ, ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ 3D20E ਦੀ ਬਜਾਏ 20E EcK2 ਦਾ ਪਸੰਦੀਦਾ ਟੀਚਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਸਾਡੇ RNA-seq ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, EcK2 ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੇ LRT ਵਿੱਚ ਵੀ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਜਿੱਥੇ ਇਸਨੂੰ ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬੰਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2b)। ਅਸੀਂ ਇਹਨਾਂ ਡੇਟਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ EcK2 ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਖੂਨ ਦੇ ਖੁਆਉਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਇਆ ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5a)। ਸਾਡੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ MS ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਕਿ 20E22P ਦਾ ਸਿਖਰ 20E ਦੇ ਸਿਖਰ ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸੀ (ਖੂਨ ਦੇ ਭੋਜਨ ਤੋਂ 22-26 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ; ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5b)। ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਵਿੱਚ EcK2 ਨੂੰ ਚੁੱਪ ਕਰਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਖੂਨ ਦੇ ਭੋਜਨ ਤੋਂ 26 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ 20E ਤੋਂ 20E22P ਦੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ 3 ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 2c ਅਤੇ 5c), ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ EcK2 ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ 20E ਨੂੰ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟ ਵੀ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, EcK2-ਘੱਟ ਹੋਈਆਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਨੇ ਪੂਰੀ ਜਿਨਸੀ ਗ੍ਰਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਬਣਾਈ ਰੱਖੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5d,e), ਅੱਗੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ 20E ਦਾ ਮਾਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਮੇਲਣ ਦੇ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਪੀਰੀਅਡਜ਼। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹਨਾਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਅੰਡੇ ਦੇਣ ਦੀ ਦਰ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 30% ਤੋਂ ਵੱਧ ਕੁਆਰੀਆਂ ਅੰਡੇ ਦਿੰਦੀਆਂ ਸਨ (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5f)। ਜੇਕਰ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ Eck2 RNA (dsEcK2) ਟੀਕੇ ਖੂਨ ਪੀਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਤਾਂ ਸਪੌਨਿੰਗ ਨਹੀਂ ਹੋਈ, ਜਿਸ ਸਮੇਂ ਖੂਨ ਪੀਣ ਕਾਰਨ 20E ਸਿਖਰ ਘੱਟ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਖੂਨ ਚੂਸਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੈਦਾ ਹੋਣ ਵਾਲਾ 20E ਸਪੌਨਿੰਗ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਸਿਰਫ਼ ਉਦੋਂ ਜਦੋਂ ਸਪੌਨਿੰਗ ਬਲਾਕ (EcK2 ਅਤੇ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੋਰ ਕਾਰਕ) ਮੇਲਣ ਦੁਆਰਾ ਬੰਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਨਾ ਤਾਂ 20E ਅਤੇ ਨਾ ਹੀ 3D20E ਟੀਕਿਆਂ ਨੇ ਕੁਆਰੀਆਂ ਵਿੱਚ EcK2 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5g), ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹੋਰ ਕਾਰਕ ਇਸ ਕਾਇਨੇਜ ਦੇ ਰੋਕਥਾਮ ਵਿੱਚ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਖੂਨ ਪੀਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 20E ਪੱਧਰ ਮੇਲਣ ਦੀ ਬੇਅਰਾਮੀ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਨਹੀਂ ਸਨ, ਪਰ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤੇ 3D20E ਦੇ ਉੱਚ ਟਾਈਟਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਚਾਲੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ A. gambiae ਦੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਸਫਲਤਾ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਵਿਧੀਆਂ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੂਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਸਾਹਮਣੇ ਆਇਆ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਨਰ 3D20E ਦੇ ਉੱਚ ਟਾਈਟਰਾਂ ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਕਸਤ ਹੋਏ ਹਨ, ਇੱਕ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ ecdysone ਜੋ ਔਰਤਾਂ ਨੂੰ ਹੋਰ ਮੇਲਣ ਲਈ ਅਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਬਣਾ ਕੇ ਮਾਪਿਆਂ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਇਸਦੇ ਨਾਲ ਹੀ, ਇਹਨਾਂ ਮਲੇਰੀਆ ਵੈਕਟਰਾਂ ਨੇ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ EPP ਦੇ ਜਿਨਸੀ ਤਬਾਦਲੇ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਔਰਤਾਂ ਵਿੱਚ 3D20E ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕੁਸ਼ਲ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵੀ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤੀ ਹੈ। ਸਾਡੇ ਗਿਆਨ ਅਨੁਸਾਰ, ਇਹ ਕੀੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਅਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਾਰਜ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਨਰ- ਅਤੇ ਮਾਦਾ-ਪ੍ਰਧਾਨ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਪਹਿਲੀ ਉਦਾਹਰਣ ਹੈ। ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ecdysone ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਪਰ ਨਿਸ਼ਚਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਗਲਤ ਪਰਿਕਲਪਨਾ 18 ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਕਾਰਜ 20E ਪੂਰਵਗਾਮੀ E1 ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਡਰੋਸੋਫਿਲਾ ਵਿੱਚ, ਮੋਨੈਂਡਰੀ ਛੋਟੇ ਲਿੰਗ ਪੇਪਟਾਇਡ 19,20 ਦੇ ਜਿਨਸੀ ਤਬਾਦਲੇ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਖਾਸ ਲਿੰਗ ਪੇਪਟਾਇਡ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਮਾਦਾ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟ੍ਰੈਕਟ ਨੂੰ ਅੰਦਰ ਲਿਆਉਣ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨਾਲ ਗੱਲਬਾਤ ਕਰਦੇ ਹਨ21,22। ਹੋਰ ਕੰਮ ਹੈ A. gambiae ਮਾਦਾਵਾਂ ਵਿੱਚ 3D20E ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਕੈਸਕੇਡਾਂ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਇਹਨਾਂ ਕੈਸਕੇਡਾਂ ਨੂੰ ਮੱਛਰਾਂ ਅਤੇ ਡਰੋਸੋਫਿਲਾ ਵਿਚਕਾਰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਾਦਾ ਉਪਜਾਊ ਸ਼ਕਤੀ ਅਤੇ ਵਿਵਹਾਰ 'ਤੇ 3D20E ਦੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, 3D20E ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਰਸਤੇ ਭਵਿੱਖ ਦੀਆਂ ਮੱਛਰ ਨਿਯੰਤਰਣ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਲਈ ਨਵੇਂ ਮੌਕੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪ੍ਰਤੀਯੋਗੀ ਨਿਰਜੀਵ ਨਰਾਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨਿਰਜੀਵ ਕੀਟ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਜੰਗਲੀ ਰਿਹਾਈ ਲਈ ਵਰਤੋਂ ਜਾਂ ਕੁਆਰੀ ਖੇਡ ਵਿੱਚ 3D20E ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਲਈ। 3D20E ਦਾ ਨਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਕਾਰਜ ਉਦੋਂ ਵਿਕਸਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ A. gambiae ਅਤੇ ਹੋਰ Cellia ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਨੇ ਆਪਣੇ ਵੀਰਜ ਨੂੰ ਮੇਲਣ ਵਾਲੇ ਪਲੱਗਾਂ ਵਿੱਚ ਜਮ੍ਹਾ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਹਾਰਮੋਨ ਅਤੇ ਹਾਰਮੋਨ-ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਕੁਸ਼ਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ, 3D20E ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਮੋਨੈਂਡਰੀ ਔਰਤਾਂ ਲਈ (MISO ਦੇ ਉੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ) ਉੱਚ ਮਲੇਰੀਆ ਪ੍ਰਚਲਨ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਜਨਨ ਤੰਦਰੁਸਤੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਅਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮੋਡੀਅਮ ਸੰਚਾਰ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਮਾਦਾ 20E ਨੂੰ ਮਾਦਾ ਐਨੋਫਿਲੀਜ਼ ਮੱਛਰਾਂ ਵਿੱਚ P. falciparum ਦੇ ਬਚਾਅ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸ 'ਤੇ ਡੂੰਘਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, 24 ਨਰ ਅਤੇ ਮਾਦਾ ਦੋਵੇਂ ਸਟੀਰੌਇਡ ਹਾਰਮੋਨ ਮਾਰਗ ਹੁਣ ਮੱਛਰ-ਪਰਜੀਵੀ ਦੇ ਮੁੱਖ ਪਹਿਲੂ ਹਨ। ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ।
A. gambiae G3 ਕਿਸਮਾਂ ਨੂੰ ਮਿਆਰੀ ਕੀਟ ਹਾਲਤਾਂ (26-28 °C, 65-80% ਸਾਪੇਖਿਕ ਨਮੀ, 12:12 ਘੰਟੇ ਹਲਕਾ/ਹਨੇਰਾ ਫੋਟੋਪੀਰੀਅਡ) ਅਧੀਨ ਪਾਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਲਾਰਵੇ ਨੂੰ ਪਾਊਡਰ ਮੱਛੀ ਭੋਜਨ (ਟੈਟਰਾਮਿਨ ਟ੍ਰੋਪਿਕਲ ਫਲੇਕਸ, ਕੋਈ ਪੈਲੇਟਸ ਅਤੇ ਟੈਟਰਾ ਪੌਂਡ ਸਟਿਕਸ 7:7:2 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ) ਖੁਆਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਲਗ ਮੱਛਰਾਂ ਨੂੰ ਐਡ ਲਿਬਿਟਮ 10% ਡੈਕਸਟ੍ਰੋਜ਼ ਘੋਲ ਅਤੇ ਹਫਤਾਵਾਰੀ ਮਨੁੱਖੀ ਖੂਨ (ਖੂਨ ਦੇ ਹਿੱਸਿਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ) ਖੁਆਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੁਆਰਾ ਸਿਰਿਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪੁਪਲ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਲਿੰਗਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਕੇ ਕੁਆਰੀ ਮੱਛਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। DsRed ਟ੍ਰਾਂਸਜੀਨ ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਨਰਾਂ ਦਾ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਜ਼ਬਰਦਸਤੀ ਮੇਲਣ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਕੁਦਰਤੀ ਮੇਲਣ ਲਈ, 4-ਦਿਨ ਦੀਆਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦੋ ਰਾਤਾਂ ਲਈ ਜਿਨਸੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਿਪੱਕ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਦੇ ਨਾਲ 1:3 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਉਹਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਮਰਦਾਂ ਨੂੰ dsEPP ਨਾਲ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਸਹਿ-ਕੇਜਿੰਗ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 3-4 ਦਿਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਚੁੱਪ ਕਰਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 2b)।
ਮੱਛਰ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ, ਬਾਕੀ ਲਾਸ਼ਾਂ (ਸਰੀਰ ਦਾ ਬਾਕੀ ਹਿੱਸਾ), ਜਾਂ ਪੂਰੇ ਸਰੀਰ ਨੂੰ 100% ਮੀਥੇਨੌਲ ਵਿੱਚ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਬੀਡਰ (2 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕੇ, 2,400 rpm, 90 ਸਕਿੰਟ) ਨਾਲ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟਿਸ਼ੂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਮੀਥੇਨੌਲ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਸੀ: ਸਰੀਰ ਦਾ ਬਾਕੀ ਹਿੱਸਾ, 1,000 µl ਵਿੱਚ 50; MAG, 50–100 80 µl; ਮਾਦਾ LRT, 25–50 80 µl। ਮਿਥੇਨੌਲ ਦੀ ਇੱਕੋ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਨਾਲ ਦੂਜੀ ਮਿਥੇਨੌਲ ਕੱਢਣ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੈੱਲ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੋਵਾਂ ਕੱਢਣ ਤੋਂ ਮਿਥੇਨੌਲ ਨੂੰ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦੇ ਅਧੀਨ ਸੁੱਕਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ 80% ਮੀਥੇਨੌਲ ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਖੰਡਾਂ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: ਸਰੀਰ ਦਾ ਬਾਕੀ ਹਿੱਸਾ, 50 µl; MAG ਅਤੇ ਮਾਦਾ LRT, 30 µl।
ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ID-X, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) 'ਤੇ ਇੱਕ LC ਯੰਤਰ (Vanquish, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। 5 µl ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 25 °C 'ਤੇ ਰੱਖੇ ਗਏ 3 µm, 100 × 4.6 mm ਕਾਲਮ (ਇੰਸਪਾਇਰ C8, ਡਿਕਮਾ) 'ਤੇ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। LC ਲਈ ਮੋਬਾਈਲ ਪੜਾਅ A (ਪਾਣੀ, 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਅਤੇ B (ਐਸੀਟੋਨਾਈਟਰਾਈਲ, 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਸਨ। LC ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਸੀ: 1 ਮਿੰਟ ਲਈ 5% B, ਫਿਰ 11 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ 100% B ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ। 100% 'ਤੇ 8 ਮਿੰਟਾਂ ਬਾਅਦ, 4 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 5% B 'ਤੇ ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰੋ। ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 0.3 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ-1 ਸੀ। MS ਸਰੋਤ ਵਿੱਚ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਅਤੇ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਮੋਡਾਂ ਵਿੱਚ ਗਰਮ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਪੂਰੇ MS ਮੋਡ ਵਿੱਚ 60,000 ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 'ਤੇ 350 ਤੋਂ 680 ਤੱਕ m/z ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਮਾਪਦਾ ਹੈ।MS/MS ਡੇਟਾ [M + H]+ (ਸਾਰੇ ਟੀਚੇ), [M - H2O + H]+ (ਸਾਰੇ ਟੀਚੇ), ਅਤੇ [M - H]- (ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਿਡ ਟੀਚੇ) 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।MS/MS ਡੇਟਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਟੀਚਿਆਂ ਦੇ ecdysone ਗੁਣਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਲਈ ਕੋਈ ਮਿਆਰ ਉਪਲਬਧ ਨਹੀਂ ਸੀ। ਗੈਰ-ਨਿਸ਼ਾਨਾਬੱਧ ecdysteroids ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ, 15% ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਾਪੇਖਿਕ ਭਰਪੂਰਤਾ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ HPLC ਸਿਖਰਾਂ ਲਈ MS/MS ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਖਾਸ ਨਮੂਨੇ (ਹੋਰ ਸਾਰੇ ਟੀਚਿਆਂ) ਦੀ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਜਾਂ ਪਤਲਾਪਣ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਸ਼ੁੱਧ ਮਿਆਰਾਂ (20E, 3D20E) ਤੋਂ ਬਣਾਏ ਗਏ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੁਆਂਟੀਫਾਈ ਕਰੋ ਤਾਂ ਜੋ ਇੱਕ ਨਰ ਵਿੱਚ ਪਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਦੇ ਬਰਾਬਰਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ। 3D20E ਲਈ, ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਐਡਕਟਾਂ ਦੇ ਜੋੜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੁਆਂਟੀਫਾਈਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-।ਟਰੇਸਫਾਈਂਡਰ (ਵਰਜਨ 4.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਕੱਢਿਆ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। Xcalibur (ਵਰਜਨ 4.4) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ MS/MS ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। E, 20E ਅਤੇ 3D20E ਦੇ MS ਸਪੈਕਟਰਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਿਆਰਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ।3D20E22P ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਗਿਰਾਰਡ ਦੇ ਰੀਐਜੈਂਟ ਨਾਲ ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।20E22P ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ m/z ਅਨੁਪਾਤ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
3D20E22P ਨੂੰ MAG ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। HPLC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਸਮਾਨ LC ਹਾਲਤਾਂ ਦੇ ਤਹਿਤ ਇੱਕ ਕੁਆਡ੍ਰਪੋਲ ਪੁੰਜ-ਅਧਾਰਤ ਡਿਟੈਕਟਰ (QDa, Acquity, Waters) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਅਲਟਰਾ-ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫ (Acquity, Waters) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਪੈਮਾਨੇ 'ਤੇ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਭਿੰਨ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਉਦੋਂ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਇਆ ਜਦੋਂ 3D20E22P ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ m/z ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਉਸੇ ਧਾਰਨ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਕੱਢੇ ਗਏ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ HPLC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ TRI ਰੀਐਜੈਂਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 10-12 ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਜਾਂ ਸਰੀਰ ਦੇ ਹੋਰ ਹਿੱਸਿਆਂ (ਸਿਰ ਰਹਿਤ) ਤੋਂ ਕੁੱਲ RNA ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। RNA ਦਾ TURBO DNase (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। cDNA ਨੂੰ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮੋਲੋਨੀ ਮਿਊਰੀਨ ਲਿਊਕੇਮੀਆ ਵਾਇਰਸ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ (M-MLV RT; ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਆਂਟਿਟੀਟਿਵ PCR (RT-qPCR; ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2) ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ24 ਜਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-BLAST26 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 70-150 bp ਆਕਾਰ ਅਤੇ ਫੈਲਣ ਵਾਲੇ ਐਕਸੋਨ-ਐਕਸੋਨ ਜੰਕਸ਼ਨ ਜਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪੇਅਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵੱਖਰੇ ਐਕਸੋਨ ਵਾਲੇ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਤਰਜੀਹ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਤਿੰਨ ਤੋਂ ਚਾਰ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ cDNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ RT-qPCR ਲਈ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੁਆਂਟੀਫਿਕੇਸ਼ਨ 15 µl ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1× PowerUp SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਮਾਸਟਰ ਮਿਕਸ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ), ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਅਤੇ 5 µl ਪਤਲਾ cDNA ਸੀ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਇੱਕ 'ਤੇ ਚਲਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। QuantStudio 6 Pro ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ PCR ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਵਰਜਨ 2.4.3) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਰਿਬੋਸੋਮਲ ਜੀਨ RpL19 (AGAP004422) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਖੂਨ ਖੁਆਉਣਾ 27 ਜਾਂ ਮੇਲ 3 ਨਾਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਬਦਲਿਆ।
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ RNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ। Illumina ਪੇਅਰਡ-ਐਂਡ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ ਅਤੇ MIT ਅਤੇ ਹਾਰਵਰਡ ਦੇ ਬਰਾਡ ਇੰਸਟੀਚਿਊਟ ਵਿਖੇ ਚਲਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ HISAT2 (ਵਰਜਨ 2.0.5) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ A. gambiae ਜੀਨੋਮ (PEST ਸਟ੍ਰੇਨ, ਵਰਜਨ 4.12) ਨਾਲ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਰੀਡਸ ਨੂੰ ਇਕਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮੈਪਿੰਗ ਕੁਆਲਿਟੀ (MAPQ) ਸਕੋਰ ਵਾਲੇ ਰੀਡਸ <30 ਨੂੰ Samtools (ਵਰਜਨ 1.3.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਜੀਨਾਂ ਨਾਲ ਮੈਪ ਕੀਤੇ ਰੀਡਸ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ htseq-count (ਵਰਜਨ 0.9.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। R (ਵਰਜਨ 4.0.3) ਵਿੱਚ DESeq2 ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 1.28.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਧਾਰਣ ਰੀਡ ਗਿਣਤੀਆਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
Ecdysone-ਸੋਧਣ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਪਹਿਲਾਂ PSI-BLAST ਐਲਗੋਰਿਦਮ (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ A. gambiae ਜੀਨੋਮ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਡਿਫਾਲਟ ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਪੁੱਛਗਿੱਛ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਾਲੇ ਪੈਰਾਮੀਟਰ: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ਅਤੇ XP_011294434.1) ਅਤੇ Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 ਅਤੇ XP_008552645.1) EcK from B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), ਐਪਿਸ ਮੇਲੀਫੇਰਾ (ਐਕਸੈਸ਼ਨ ਨੰ. XP_394838) ਅਤੇ ਐਸੀਰਥੋਸੀਫੋਨ ਪਿਸਮ (ਐਕਸੈਸ਼ਨ ਨੰ. XP_001947166); ਅਤੇ ਬੀ. ਮੋਰੀ (ਐਕਸੈਸ਼ਨ ਨੰ. XP_001177919.1 ਅਤੇ NP_001243996.1) ਤੋਂ EPP ਅਤੇ ਡੀ. ਮੇਲਾਨੋਗਾਸਟਰ (ਐਕਸੈਸ਼ਨ ਨੰ. NP_572986.1) ਦੇ EO (ਕਦਮ 1)। ਅੱਗੇ, ਗੈਂਬੀਆ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂ (ਮਾਦਾ LRT ਜਾਂ MAG) ਵਿੱਚ ਉੱਚ mRNA ਸਮੀਕਰਨ (>100 ਟੁਕੜੇ/ਕਿਲੋਬੇਸ ਐਕਸੋਨ ਪ੍ਰਤੀ ਮਿਲੀਅਨ ਮੈਪਡ ਰੀਡ (FPKM) ਜਾਂ >85%) ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਫਿਲਟਰ ਹਿੱਟ (ਕਦਮ 2)। ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਉਮੀਦਵਾਰ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਚੁਣੇ ਜੋ ਏ. ਐਲਬੀਮੈਨਸ ਦੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇੱਕ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਪ੍ਰਜਾਤੀ ਜੋ ਮੇਲ ਦੌਰਾਨ ਇਕਡੀਸੋਨ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਜਾਂ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ। ਉਮੀਦਵਾਰ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਏ. ਐਲਬੀਮੈਨਸ ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂ (ਕਦਮ 3) ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (<100 FPKM ਜਾਂ <85ਵਾਂ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਅੰਤਮ ਫਿਲਟਰ (ਕਦਮ 4) ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ, ਉਮੀਦਵਾਰ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਇੱਕ ਨੂੰ ਸੰਤੁਸ਼ਟ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ: (1) ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ (P < 0.05) ਵਿਭਿੰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਤੇ (2) ਗੈਰ-ਪ੍ਰਜਨਨ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ (< 85% ਜਾਂ < 100 FPKM)।
ਅਸੀਂ ਪੂਰੇ-ਜੀਵਾਣੂ ਆਈਸੋਟੋਪਿਕ ਲੇਬਲਿੰਗ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਤਰੀਕਿਆਂ 28,29,30 ਨੂੰ ਸੋਧਿਆ ਹੈ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ Saccharomyces cerevisiae ਕਿਸਮ II (YSC2, ਸਿਗਮਾ) ਨੂੰ ਖਮੀਰ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਬੇਸ (BD Difco, DF0335) ਵਿੱਚ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ (wt/vol) 2% ਗਲੂਕੋਜ਼ (G7528, ਸਿਗਮਾ), 1.7% ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ-ਮੁਕਤ ਅਤੇ ਅਮੋਨੀਅਮ ਸਲਫੇਟ। ਕਲਚਰ ਮਾਧਿਅਮ) ਅਤੇ 5% 15N ਅਮੋਨੀਅਮ ਸਲਫੇਟ (NLM-713, >99%, ਕੈਂਬਰਿਜ ਆਈਸੋਟੋਪ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼) ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਦੇ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਸਰੋਤ ਵਜੋਂ ਸਨ। ਖਮੀਰ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਬਰਾਮਦ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮੱਛਰ ਦੇ ਲਾਰਵੇ ਨੂੰ ਪਿਊਪੇਸ਼ਨ ਤੱਕ ਐਡ ਲਿਬਿਟਮ ਖੁਆਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੌਥੇ ਇੰਸਟਾਰ ਮੌਤ ਦਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਫਿਸ਼ਮੀਲ (0.5 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਪ੍ਰਤੀ 300 ਲਾਰਵੇ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ। ਫਿਰ ਮੇਲਣ ਦੌਰਾਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਨਰਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲਣ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
4-6 ਦਿਨ ਦੀਆਂ 15N-ਟੈਗ ਕੀਤੀਆਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ ਉਮਰ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਅਣ-ਟੈਗ ਕੀਤੇ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਨਾਲ ਮੇਲ ਕਰਨ ਲਈ ਮਜਬੂਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਪੀਫਲੋਰੇਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਦੇ ਤਹਿਤ ਮੇਲ ਪਲੱਗਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਕੇ ਸਫਲ ਮੇਲ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ। 3, 12, ਅਤੇ 24 hpm 'ਤੇ, 45-55 ਮੇਲ ਕੀਤੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੇ ਐਟ੍ਰੀਆ ਨੂੰ 50 µl ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ ਬਫਰ (pH 7.8) ਵਿੱਚ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਪੈਸਟਲ ਨਾਲ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਹੋਮੋਜਨੇਟ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 50 µl 0.1% ਰੈਪੀਗੇਸਟ (186001860, ਵਾਟਰਸ) ਦੇ 50 µl 50 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਤੋਂ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਅਤੇ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਸੁੱਕੀ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਸਨੈਪ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ ਵਾਸ਼ਿੰਗਟਨ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਵਿਖੇ ਮੈਕਕੋਸ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਭੇਜਿਆ ਗਿਆ, ਜਿੱਥੇ LC-MS/MS ਲਈ ਨਮੂਨਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨਾ ਪੂਰਾ ਹੋ ਗਿਆ। 50 µl 0.1% ਰੈਪੀਗੇਸਟ ਵਿੱਚ 50 µl ਵਿੱਚ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕਰੋ। ਪਾਣੀ ਦੇ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ ਅਤੇ ਸੋਨਿਕੇਟ। ਪੈਲੇਟ ਅਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ BCA ਪਰਖ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 5 mM ਡਾਇਥੀਓਥ੍ਰੀਟੋਲ (DTT; ਸਿਗਮਾ) ਨਾਲ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, 15 mM ਆਇਓਡੋਐਸੀਟਾਮਾਈਡ (ਸਿਗਮਾ) ਨਾਲ ਅਲਕਾਈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ: ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ: ਸਬਸਟਰੇਟ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਨਾਲ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 37 °C (1:0 50) 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰੈਪੀਗੈਸਟ ਨੂੰ 200 mM HCl ਦੇ ਜੋੜ ਦੁਆਰਾ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 37 °C 'ਤੇ 45 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ 4 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 14,000 rpm 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਦੋਹਰੇ-ਮੋਡ ਸਾਲਿਡ-ਫੇਜ਼ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ (Oasis MCX ਕਾਰਤੂਸ, ਵਾਟਰਸ) ਦੁਆਰਾ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 0.33 µg µl-1 ਦੀ ਅੰਤਿਮ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਈ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ MAG ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਦਾ ਵੀ ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਮਰਦਾਂ ਤੋਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੋ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਅੱਗੇ, ਹਰੇਕ ਦੇ 1 µg ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ 25-cm ਫਿਊਜ਼ਡ ਸਿਲਿਕਾ 75-μm ਕਾਲਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 4-cm ਫਿਊਜ਼ਡ ਸਿਲਿਕਾ Kasil1 (PQ) ਫਰਿਟ ਟ੍ਰੈਪ ਸੀ ਜੋ Jupiter C12 ਰਿਵਰਸਡ-ਫੇਜ਼ ਰੈਜ਼ਿਨ (Phenomenex) ਅਤੇ 180-ਮਿੰਟ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਨਾਲ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਾ ਡਾਈਜੈਸਟ - MS/MS ਨੂੰ ਇੱਕ Q-Exactive HF ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) 'ਤੇ ਇੱਕ ਨੈਨੋਏਕਿਉਟੀ UPLC ਸਿਸਟਮ (ਵਾਟਰਸ) ਨਾਲ ਚਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ ਰਨ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਡੇਟਾ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਓਵਿਜ਼ਾਰਡ (ਵਰਜਨ 3.0.20287) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਕੋਮੇਟ31 (ਵਰਜਨ 3.2) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ FASTA ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ mzML ਫਾਰਮੈਟ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਨੋਫਿਲਜ਼ ਗੈਂਬੀਆ (ਵੈਕਟਰਬੇਸ ਵਰਜਨ 54), ਐਨੋਫਿਲਜ਼ ਕੋਲੂਜ਼ੀ ਤੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ। ਮਾਲੀ-ਐਨਆਈਐਚ (ਵੈਕਟਰਬੇਸ ਵਰਜਨ 54), ਸੈਕੈਰੋਮਾਈਸਿਸ ਸੇਰੇਵਿਸੀਆ (ਯੂਨੀਪ੍ਰੋਟ, ਮਾਰਚ 2021), ਏ. ਗੈਂਬੀਆ ਆਰਐਨਏ-ਸੀਕ, ਅਤੇ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਮਨੁੱਖੀ ਦੂਸ਼ਿਤ ਤੱਤਾਂ ਦੇ ਤਿੰਨ-ਫ੍ਰੇਮ ਅਨੁਵਾਦਾਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ਖੋਜ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪੇਪਟਾਈਡ ਮੈਪ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ FDRs ਨੂੰ Percolator32 (ਵਰਜਨ 3.05) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 0.01 ਦੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਨਾਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਲਾਈਮਲਾਈਟ33 ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਾਰਸੀਮੋਨੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਛਾਣਾਂ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। (ਵਰਜਨ 2.2.0)। ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਅਨੁਸਾਰ ਹਰੇਕ ਰਨ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਧਾਰਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਭਰਪੂਰਤਾ ਕਾਰਕ (NSAF) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਭਰਪੂਰਤਾ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ NSAF ਨੂੰ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਤੋਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਔਸਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 15N ਲੇਬਲਿੰਗ ਨੇ ਮਾਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨੂੰ ਸਫਲਤਾਪੂਰਵਕ ਮਾਸਕ ਕੀਤਾ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਲੇਬਲ ਕੀਤੀਆਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਤੋਂ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਸੀ। ਅਸੀਂ ਮਾਦਾ ਕੱਚੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਮਰਦ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਮੀ (1-5 ਸਪੈਕਟਰਾ) ਦਾ ਪਤਾ ਸਿਰਫ਼ ਤਕਨੀਕੀ ਦੌੜਾਂ ਵਿੱਚ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ, ਜਿੱਥੇ ਕੱਚੇ ਨਮੂਨੇ ਨਰ/ਮੇਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਚਲਾਏ ਗਏ ਸਨ, HPLC "ਕੈਰੀ ਓਵਰ" ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ। ਲੇਬਲ ਕੀਤੀਆਂ ਕੁਆਰੀਆਂ ਤੋਂ 'ਦੂਸ਼ਿਤ' ਵਜੋਂ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਕਦੇ-ਕਦਾਈਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ।
Genscript ਵਿੱਚ ਦੋ ਐਂਟੀਜੇਨਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡ, QTTDRVAPAPDQQQ (ਆਈਸੋਟਾਈਪ PA ਦੇ ਅੰਦਰ) ਅਤੇ MESDGTTPSGDSEQ (ਆਈਸੋਟਾਈਪ PA ਅਤੇ PB ਦੇ ਅੰਦਰ)। ਦੋ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ, ਫਿਰ ਕੈਰੀਅਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ KLH ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਨਿਊਜ਼ੀਲੈਂਡ ਦੇ ਖਰਗੋਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ। ਚੌਥੇ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਖਰਗੋਸ਼ਾਂ ਦੀ ਬਲੀ ਦਿੱਤੀ ਗਈ, ਅਤੇ ਕੁੱਲ IgG ਨੂੰ ਐਫੀਨਿਟੀ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ EPP-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਖਰਗੋਸ਼ ਤੋਂ IgG ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਹੋਰ ਪੱਛਮੀ ਬਲੋਟਿੰਗ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ।
ਪੱਛਮੀ ਧੱਬਿਆਂ ਲਈ, MAG (n = 10, ਜਿੱਥੇ n ਜੈਵਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਮੱਛਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ) ਅਤੇ 4-ਦਿਨ ਦੇ ਕੁਆਰੀਆਂ ਨਰਾਂ ਅਤੇ ਕੁਆਰੀਆਂ ਜਾਂ ਜ਼ਬਰਦਸਤੀ-ਮੇਲ ਕੀਤੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ (<10 ਮੇਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ), ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਬਫਰ (50 mM ਟ੍ਰਿਸ, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% ਸੋਡੀਅਮ ਡੀਓਕਸੀਕੋਲੇਟ; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਕਾਕਟੇਲ (ਰੋਚੇ)) ਤੋਂ ਮਾਦਾ LRT (n = 30) ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਬੀਡਰ (2 mm ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕੇ, 2,400 rpm, 90 ਸਕਿੰਟ) ਨਾਲ ਵਿਭਾਜਨ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਬਾਅਦ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਮਲਬੇ ਨੂੰ 4 °C 'ਤੇ 20,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨੂੰ ਬ੍ਰੈਡਫੋਰਡ ਅਸੇ (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ) ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ, 20 µg MAG ਪ੍ਰੋਟੀਨ, 40 µg LRT ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਅਤੇ 20 µg ਬਚੇ ਹੋਏ ਬਲਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ MOPS ਬਫਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 10% Bis-Tris NuPAGE ਦੁਆਰਾ ਡੀਨੇਚਰਡ ਅਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। iBlot2 ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪੌਲੀਵਿਨਾਇਲਾਈਡੀਨ ਫਲੋਰਾਈਡ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਝਿੱਲੀਆਂ ਨੂੰ 1× PBS-T (PBS ਵਿੱਚ 0.1% Tween-20) ਵਿੱਚ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 22°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਓਡੀਸੀ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ (Li-Cor) ਵਿੱਚ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਝਿੱਲੀਆਂ ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ ਕਸਟਮ ਖਰਗੋਸ਼ ਐਂਟੀ-EPP ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1:700) ਅਤੇ ਚੂਹਾ ਐਂਟੀ-ਐਕਟਿਨ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ MAC237 (Abeam; 1:4,000) ਨਾਲ ਹਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਝਿੱਲੀਆਂ ਨੂੰ PBS-T ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ (ਖੋਤਾ ਐਂਟੀ-ਖਰਗੋਸ਼ 800CW ਅਤੇ ਬੱਕਰੀ ਐਂਟੀ-ਚੂਹਾ 680LT (Li-Cor), ਦੋਵੇਂ 1:20,000) ਨਾਲ 0.01% SDS ਵਾਲੇ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 22 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 0.2% ਟਵਿਨ -20। ਝਿੱਲੀਆਂ ਨੂੰ PBS-T ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਓਡੀਸੀ CLx ਸਕੈਨਰ ਨਾਲ ਚਿੱਤਰਿਆ ਗਿਆ। ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਚਿੱਤਰ ਸਟੂਡੀਓ (ਵਰਜਨ 5.2) ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ। EPP-RA ਆਈਸੋਫਾਰਮ (82 kDa) ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਇੱਕ ਖਾਸ ਬੈਂਡ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲੱਗਿਆ।
EPP ਦੇ ਕੋਡਿੰਗ ਖੇਤਰਾਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਆਈਸੋਫਾਰਮ AGAP002463-RB ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਡੋਮੇਨ ਹੈ, NCBI ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਡੋਮੇਨ ਖੋਜ 34) ਅਤੇ EcK2 (AGAP002181) ਨੂੰ pET-21a(+) ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ (ਨੋਵੇਜਨ ਮਿਲੀਪੋਰ ਸਿਗਮਾ) ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ। pET-21a(+)-EcK2 ਨਿਰਮਾਣ ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ 6xHis ਟੈਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅੱਠ GS4 ਲਿੰਕਰ (ਟੈਂਡਮ ਵਿੱਚ) ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ। NEBExpress ਸੈੱਲ-ਮੁਕਤ E. coli ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਜ਼) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। NEBExpress Ni ਸਪਿਨ ਕਾਲਮ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਜ਼) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। NEBExpress ਸੈੱਲ-ਮੁਕਤ E. coli ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਕਿੱਟ ਤੋਂ DNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡਾਈਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਲੇਟ ਰੀਡਕਟੇਸ (DHFR) ਕੰਟਰੋਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ PBS ਵਿੱਚ 50% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਵਿੱਚ -20 °C 'ਤੇ 3 ਮਹੀਨਿਆਂ ਤੱਕ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
EPP ਅਤੇ ਟਿਸ਼ੂ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੀ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ 4-ਨਾਈਟਰੋਫਿਨਾਇਲ ਫਾਸਫੇਟ (pNPP; ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 25 mM ਟ੍ਰਿਸ, 50 mM ਐਸੀਟਿਕ ਐਸਿਡ, 25 mM ਬਿਸ-ਟ੍ਰਿਸ, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ਅਤੇ 1 mM DTT ਸੀ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 2.5 mg ml-1 pNPP ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਜਾਂ ਟਿਸ਼ੂ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਜੋੜ ਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰੋ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ pNPP ਤੋਂ ਬਦਲੇ ਗਏ pNP ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੇਂ 'ਤੇ 405 nm 'ਤੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪ ਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇਨ ਵਿਟਰੋ EcK ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 200 µl ਬਫਰ (pH 7.5) ਵਿੱਚ 0.2 mg 20E ਜਾਂ 3D20E ਨਾਲ 27 °C 'ਤੇ 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ਅਤੇ 10 mM MgCl2 ਵਾਲੇ 0.2 mg 20E ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ 800 µl ਮੀਥੇਨੌਲ ਜੋੜ ਕੇ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ -20 °C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਠੰਡਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ 4 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 20,000 g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦਾ ਫਿਰ HPLC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੰਟਰੋਲ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਗਰਮੀ-ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 95°C 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ PBS ਵਿੱਚ 50% ਗਲਿਸਰੋਲ ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇਨ ਵਿਟਰੋ EPP ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 100 µl ਬਫਰ (pH 7.5) ਵਿੱਚ 3D20E22P (MAG ਦੇ 18 ਜੋੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪਾਈ ਗਈ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਬਰਾਬਰ, HPLC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ਅਤੇ 1 mM DTT 27 °C 'ਤੇ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਸੀ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ 400 µl ਮੀਥੇਨੌਲ ਜੋੜ ਕੇ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ -20 °C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਠੰਡਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਫਿਰ 4 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 20,000 g 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦਾ HPLC-MS/MS ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ਅਤੇ EcK2 (556 bp) ਲਈ PCR ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਮਿਸ਼ਰਤ-ਲਿੰਗ ਦੇ ਸਿਰ ਰਹਿਤ ਮੱਛਰ ਦੀਆਂ ਲਾਸ਼ਾਂ ਤੋਂ ਤਿਆਰ cDNA ਤੋਂ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। eGFP ਕੰਟਰੋਲ (495 bp) ਦੇ PCR ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ pCR2.1-eGFP ਤੋਂ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ; ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ। ਪੀਸੀਆਰ ਟੁਕੜਾ pL4440 ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ 'ਤੇ ਉਲਟ T7 ਪ੍ਰਮੋਟਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨਿਰਮਾਣ NEB 5-α ਸਮਰੱਥ ਈ. ਕੋਲੀ (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਬਾਇਓਲੈਬਸ) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਵਰਤੋਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਡੀਐਨਏ ਸੀਕਵੈਂਸਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਇਨਸਰਟ ਕ੍ਰਮ ਲਈ ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਡੇਟਾ 1 ਵੇਖੋ)। T7 ਪ੍ਰਮੋਟਰ (ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2) ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ pL4440-ਅਧਾਰਤ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਤੋਂ ਇਨਸਰਟ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਆਕਾਰ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। dsRNA ਨੂੰ ਮੈਗਾਸਕ੍ਰਿਪਟ T7 ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਿੱਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪੀਸੀਆਰ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਤੋਂ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਸੋਧਾਂ ਨਾਲ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
dsRNA ਟੀਕੇ ਲਈ, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ਨੂੰ 10 ng nl-1 ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਬਾਲਗ ਮਰਦਾਂ ਜਾਂ ਔਰਤਾਂ (Nanoject III, Drummond) ਦੇ ਛਾਤੀ ਵਿੱਚ 1 ਦਿਨ ਦੇ ਅੰਦਰ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। RNA ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ, cDNA ਸਿੰਥੇਸਿਸ, ਅਤੇ RT-qPCR ਦੁਆਰਾ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਨੌਕਡਾਊਨ ਪੱਧਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ecdysone ਟੀਕੇ ਲਈ, 4-ਦਿਨ ਦੀ ਕੁਆਰੀ ਜਾਂ 6-ਦਿਨ ਦੀ ਕੁਆਰੀ ਖੂਨ-ਪੀਣ ਵਾਲੀਆਂ ਔਰਤਾਂ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1.3, 2.1 ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ 0.13, 0.21, ਜਾਂ 0.63 µg 20E ਜਾਂ 3D20E (Nanoject III, Drummond) ਨਾਲ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਜਾਂ 6.3 ng nl-1 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ। 100 nl 10% (vol/vol) ਈਥਾਨੌਲ ਦਾ ਟੀਕਾ ਲਗਾਓ। ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ; 10% ਈਥੇਨੌਲ ਵਿੱਚ 3D20E22P ਦਾ 100 nl (MAGs ਦੇ ਇੱਕ ਜੋੜੇ ਵਿੱਚ ਪਾਈ ਜਾਣ ਵਾਲੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ 75% ਦੇ ਬਰਾਬਰ)। ਮੱਛਰਾਂ ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੀਕਾ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਪੌਨਿੰਗ ਅਸੈਸ ਲਈ, 3-ਦਿਨ ਦੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਖੂਨ 'ਤੇ ਐਡ ਲਿਬਿਟਮ ਖੁਆਇਆ ਗਿਆ। ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੁਆਏ ਗਏ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਖੁਆਏ ਗਏ ਮੱਛਰਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿਓ। ਇਲਾਜ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ ਖੂਨ ਦੇ ਖਾਣੇ ਤੋਂ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਚਾਰ ਰਾਤਾਂ ਲਈ ਵੱਖਰੇ ਸਪੌਨਿੰਗ ਕੱਪਾਂ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਅੰਡਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਸਕੋਪ (ਸਟੇਮੀ 508, ਜ਼ੀਸ) ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ; ਮੇਲ ਵਾਲੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ ਲਈ, ਲਾਰਵੇ ਵਿੱਚ ਨਿਕਲਣ ਵਾਲੇ ਅੰਡਿਆਂ ਨੂੰ ਉਪਜਾਊ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ।
ਮੇਲਣ ਦੇ ਅਜ਼ਮਾਇਸ਼ਾਂ ਲਈ, ਮਾਦਾਵਾਂ ਨੂੰ ਇਲਾਜ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਮੇਲਣ ਪ੍ਰਤੀ ਵਿਰੋਧ ਵਿਕਸਤ ਕਰਨ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 2 ਦਿਨ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੀ ਉਮਰ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਨਰਾਂ ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਉਸੇ ਪਿੰਜਰੇ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੋ ਰਾਤਾਂ ਬਾਅਦ, ਮਾਦਾ ਉਪਜਾਊ ਵੇਸਿਕਲਾਂ ਨੂੰ ਕੱਟ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਥੌਅ ਅਤੇ ਸੋਨਿਕੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ 10 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ, 1 ਐਮਐਮ ਈਡੀਟੀਏ, ​​ਅਤੇ 25 ਐਮਐਮ NaCl (pH 8.2) ਵਾਲੇ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਛੱਡਿਆ ਗਿਆ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨੇਸ ਕੇ (0.86 µg µl-1) ਨਾਲ 55 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ, ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਕੱਚੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦੀਆਂ ਤਿਆਰੀਆਂ ਨੂੰ 10-ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ Y ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੀ qPCR ਖੋਜ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ। Y ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਕੋਈ ਮੇਲ ਨਹੀਂ ਦਰਸਾਉਂਦੀ।
ਰੀ-ਮੇਟਿੰਗ ਅਸੈਸ ਲਈ, ਫੋਰਸ-ਮੇਟਡ ਮਾਦਾਵਾਂ ਦੀ ਮੈਟਿੰਗ ਪਲੱਗਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਲਈ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਤਾਂ ਜੋ ਮੈਟਿੰਗ ਸਥਿਤੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ ਅਤੇ ਮਰਦਾਂ ਦੀ ਗੈਰ-ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਮੈਟਿੰਗ ਲਈ ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀਨੈਸ ਵਿਕਸਤ ਕਰਨ ਲਈ 2 ਦਿਨ ਦਿੱਤੇ ਗਏ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ 36 .DsRed ਟ੍ਰਾਂਸਜੈਨਿਕ ਸ਼ੁਕਰਾਣੂ ਲੈ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਮਰਦਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ ਮਾਦਾ ਪਿੰਜਰਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਦੋ ਰਾਤਾਂ ਬਾਅਦ, ਮਾਦਾਵਾਂ ਤੋਂ ਫਰਟੀਲਾਈਜਿੰਗ ਵੇਸਿਕਲਾਂ ਨੂੰ ਕੱਟ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ DsRed ਟ੍ਰਾਂਸਜੀਨ ਦੀ qPCR ਖੋਜ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ; ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਕਸਟੈਂਡਡ ਡੇਟਾ ਟੇਬਲ 2 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ। DsRed ਟ੍ਰਾਂਸਜੀਨ ਦੀ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਨੇ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ ਕਿ ਕੋਈ ਰੀ-ਮੇਟਿੰਗ ਨਹੀਂ ਹੋਈ।
3D20E ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ 37। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, 10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ 20E (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨੂੰ 10 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੋਲਿਆ ਗਿਆ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 30 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਪਲੈਟੀਨਮ ਬਲੈਕ (ਪਾਊਡਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ। ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਵਿੱਚ O2 ਦੀ ਇੱਕ ਕੋਮਲ ਧਾਰਾ ਲਗਾਤਾਰ ਬੁਲਬੁਲੀ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਜਿਸਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹਿਲਾਇਆ ਗਿਆ। 6 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ 30 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਮੀਥੇਨੌਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ। ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕਣਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵੈਕਿਊਓ ਵਿੱਚ ਸੁੱਕਣ ਲਈ ਭਾਫ਼ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ। ਸੁੱਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ HPLC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਟੀਕੇ ਲਈ 10% ਈਥੇਨੌਲ ਅਤੇ ਮੀਥੇਨੌਲ ਵਿੱਚ ਘੋਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਰਿਵਰਤਨ ਦਰ (20E ਤੋਂ 3D20E ਤੱਕ) ਲਗਭਗ 97% (ਚਿੱਤਰ 4b) ਸੀ, ਅਤੇ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ 3D20E ਦਾ MS ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਮਾਦਾਵਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4c) ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਦੰਤਕਥਾ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅੰਕੜਾ ਟੈਸਟਾਂ ਦੇ ਖਾਸ ਵੇਰਵੇ ਹਨ।ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ (ਵਰਜਨ 9.0) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਹੀ ਟੈਸਟ, ਮੈਂਟਲ-ਕੌਕਸ ਟੈਸਟ, ਅਤੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਕੋਚਰਾਨ-ਮੈਂਟਲ-ਹੈਨਜ਼ਲ ਟੈਸਟ ਇੱਕ ਕਸਟਮ ਆਰ ਸਕ੍ਰਿਪਟ (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਡੇਟਾ ਵੰਡ ਨੂੰ 0.05 ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦੇ ਨਾਲ ਸ਼ਾਪੀਰੋ-ਵਿਲਕ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਧਾਰਣਤਾ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਦੋਂ ਡੇਟਾ ਸਧਾਰਣਤਾ ਟੈਸਟ ਵਿੱਚ ਅਸਫਲ ਹੋ ਗਿਆ, ਤਾਂ ਮਾਨ-ਵਿਟਨੀ ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਰਵਾਈਵਲ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਮੈਂਟਲ-ਕੌਕਸ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। DESeq2 ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 1.28.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ RNA-seq ਜੀਨ-ਪੱਧਰ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਗ੍ਰਾਫ 'ਤੇ ਖਿਤਿਜੀ ਪੱਟੀ ਮੱਧਮਾਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਸਾਰੇ ਟੈਸਟਾਂ ਲਈ P = 0.05 ਦਾ ਮਹੱਤਵ ਮੁੱਲ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਧਿਐਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਹੋਰ ਜਾਣਕਾਰੀ ਲਈ, ਇਸ ਲੇਖ ਨਾਲ ਲਿੰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਕੁਦਰਤ ਖੋਜ ਰਿਪੋਰਟ ਸਾਰ ਵੇਖੋ।
ਐਮਐਸ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਡੇਟਾਸੈਟ ਪਛਾਣਕਰਤਾ PXD032157 ਦੇ ਨਾਲ PRIDE ਪਾਰਟਨਰ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ਰਾਹੀਂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਐਕਸਚੇਂਜ ਕੰਸੋਰਟੀਅਮ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ਵਿੱਚ ਜਮ੍ਹਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
RNA-seq ਡੇਟਾਸੈੱਟ ਨੂੰ ਸੀਰੀਅਲ ਰਿਕਾਰਡ GSE198665 ਦੇ ਤਹਿਤ ਜੀਨ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਕੰਪ੍ਰੀਹੈਂਸਿਵ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ਵਿੱਚ ਜਮ੍ਹਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
ਮੌਜੂਦਾ ਅਧਿਐਨ ਦੌਰਾਨ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਵਾਧੂ ਡੇਟਾਸੈੱਟ ਸੰਬੰਧਿਤ ਲੇਖਕਾਂ ਤੋਂ ਵਾਜਬ ਬੇਨਤੀ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਲੇਖ ਸਰੋਤ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਡੀ ਲੂਫ, ਏ. ਇਕਡਾਈਸਟੀਰੋਇਡਜ਼: ਅਣਗੌਲਿਆ ਕੀਟ ਸੈਕਸ ਸਟੀਰੌਇਡ? ਮਰਦ: ਬਲੈਕ ਬਾਕਸ। ਕੀਟ ਵਿਗਿਆਨ।13, 325–338 (2006)।
ਰੈੱਡਫਰਨ, ਸੀਪੀਐਫ 20-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਕਡਾਈਸੋਨ ਅਤੇ ਅੰਡਕੋਸ਼ ਵਿਕਾਸ ਐਨੋਫਲੀਜ਼ ਸਟੀਫਨਜ਼ ਵਿੱਚ। ਜੇ. ਇਨਸੈਕਟ ਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀ।28, 97–109 (1982)।