ਸੈੱਲ ਕੰਪਾਰਟਮੈਂਟਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਹੋਮਿਓਸਟੈਸਿਸ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਲਈ ਸੀਕ੍ਰੇਟਰੀ ਪਾਥਵੇਅ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਛਾਂਟੀ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ। ਸ਼ੈੱਲ-ਮਿਡੀਏਟਿਡ ਛਾਂਟੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸੀਕ੍ਰੇਟਰੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਕਾਇਨੇਸਿਨ ਛਾਂਟੀ ਵਿੱਚ ਲਿਪਿਡਸ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਇੱਕ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਚੱਲ ਰਿਹਾ ਬੁਨਿਆਦੀ ਸਵਾਲ ਹੈ ਜਿਸਦਾ ਅਜੇ ਤੱਕ ਜਵਾਬ ਨਹੀਂ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਸਾਬਤ ਕਰਨ ਲਈ 3D ਸਮਕਾਲੀਨ ਮਲਟੀਕਲਰ ਹਾਈ-ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਬਹੁਤ ਲੰਬੇ ਸੀਰਾਮਾਈਡ ਲਿਪਿਡ ਮੋਇਟੀਜ਼ ਵਾਲੇ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ ਗਲਾਈਕੋਸਿਲਫੋਸਫੇਟਿਡਾਈਲਿਨੋਸਿਟੋਲ-ਇਮੋਬਿਲਾਈਜ਼ਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਲੱਸਟਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮ ਨੈੱਟ ਐਗਜ਼ਿਟ ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਟੀਕੁਲਮ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸੀਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਇਸ ਛਾਂਟੀ ਚੋਣ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ। ਸਾਡਾ ਅਧਿਐਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਰੀ ਪਾਥਵੇਅ ਵਿੱਚ ਚੋਣਵੇਂ ਨਿਰਯਾਤ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਲਿਪਿਡ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਵਰਗੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪਹਿਲਾ ਸਿੱਧਾ ਇਨ ਵਿਵੋ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ, ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਟੀਕੁਲਮ (ER) ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਫਿਰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਢੁਕਵੇਂ ਸੈਲੂਲਰ ਮੰਜ਼ਿਲ (1) ਤੱਕ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ ਗੁਪਤ ਮਾਰਗ ਰਾਹੀਂ ਆਵਾਜਾਈ ਦੌਰਾਨ ਛਾਂਟਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਕੋਟ-ਮੱਧਮ ਛਾਂਟੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਰਿਹਾ ਸੀ ਕਿ ਕੁਝ ਲਿਪਿਡ ਖਾਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (2-5) ਵਾਲੇ ਖਾਸ ਝਿੱਲੀ ਡੋਮੇਨਾਂ ਵਿੱਚ ਕਲੱਸਟਰ ਕਰਕੇ ਚੋਣਵੇਂ ਨਿਕਾਸ ਬਿੰਦੂਆਂ ਵਜੋਂ ਵੀ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਸੰਭਾਵੀ ਲਿਪਿਡ-ਅਧਾਰਿਤ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸਾਬਤ ਕਰਨ ਲਈ ਅਜੇ ਵੀ ਸਿੱਧੇ ਇਨ ਵਿਵੋ ਸਬੂਤ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ। ਇਸ ਬੁਨਿਆਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕਿਵੇਂ ਗਲਾਈਕੋਸਿਲਫੋਸਫੇਟਿਡਾਈਲਿਨੋਸਿਟੋਲ (GPI) ਐਂਕਰਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (GPI-APs) ER ਤੋਂ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਯਾਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। GPI-APs ਲਿਪਿਡ-ਜੁੜੇ ਸੈੱਲ ਸਤਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਇੱਕ ਕਿਸਮ ਹਨ (6, 7)। GPI-AP ਇੱਕ ਗੁਪਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜੋ ਗਲਾਈਕੋਲਿਪਿਡ ਮੋਇਟੀ (GPI ਐਂਕਰ) ਦੁਆਰਾ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਬਾਹਰੀ ਲੀਫਲੈਟਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਉਹ GPI ਐਂਕਰਾਂ ਨੂੰ ER ਲੂਮੇਨ ਵਿੱਚ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਪੋਸਟ-ਅਨੁਵਾਦਕ ਸੋਧਾਂ ਵਜੋਂ ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਦੇ ਹਨ (8)। ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, GPI-AP ਗੋਲਗੀ ਉਪਕਰਣ (5, 9) ਰਾਹੀਂ ER ਤੋਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਤੱਕ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। GPI ਐਂਕਰਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ GPI-AP ਨੂੰ ਟਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਹੋਰ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੇਤ) ਤੋਂ ਗੁਪਤ ਮਾਰਗ (5, 9, 10) ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਿਜਾਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ। ਖਮੀਰ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ, GPI-AP ਨੂੰ ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਟੀਕੁਲਮ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਸੀਕ੍ਰੇਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਕੋਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਪਲੈਕਸ II (COPII) (6, 7) ਦੁਆਰਾ ਲਪੇਟਿਆ ਗਿਆ ਵਿਲੱਖਣ ਵੇਸਿਕਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ER ਨਿਰਯਾਤ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇਸ ਵਰਗੀਕਰਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਨਿਰਧਾਰਕ ਅਸਪਸ਼ਟ ਹਨ, ਪਰ ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਵਿਧੀ ਲਈ ਲਿਪਿਡ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ GPI ਐਂਕਰ ਦੇ ਲਿਪਿਡ ਹਿੱਸੇ ਦੀ ਢਾਂਚਾਗਤ ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ (5, 8)। ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ, GPI ਲਿਪਿਡ ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ GPI ਦੇ ਅਟੈਚ ਹੋਣ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਬਾਅਦ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਸੇਰਾਮਾਈਡ ਨੂੰ 26-ਕਾਰਬਨ ਲੰਬੀ-ਚੇਨ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਫੈਟੀ ਐਸਿਡ (C26:0) (11, 12) ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ। C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੁਣ ਤੱਕ ਖਮੀਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਮੁੱਖ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੈ। ਇਸਨੂੰ ER ਵਿੱਚ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਹਿੱਸਾ COPII ਵੇਸਿਕਲਾਂ (13) ਰਾਹੀਂ ਗੋਲਗੀ ਉਪਕਰਣ ਨੂੰ ਨਿਰਯਾਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। GPI-AP ਦੇ ER ਨਿਰਯਾਤ ਲਈ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੱਲ ਰਹੇ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ (14, 15) ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ, ਗੋਲਗੀ ਉਪਕਰਣ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ ਇਨੋਸਿਟੋਲ ਫਾਸਫੇਟ ਸਿਰਾਮਾਈਡ (IPC) ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ GPI ਐਂਕਰ ਸਿੰਥੇਸਿਸ (16) 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਨਕਲੀ ਝਿੱਲੀਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਬਾਇਓਫਿਜ਼ੀਕਲ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਬਹੁਤ ਲੰਬੇ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਵਿਲੱਖਣ ਭੌਤਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ (17, 18) ਦੇ ਨਾਲ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਡੋਮੇਨ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇਕੱਠੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਡੇਟਾ ਇਸ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਅਤੇ GPI-AP C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਗੜਬੜ ਵਾਲੇ ER ਝਿੱਲੀ ਲਿਪਿਡ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਖੇਤਰਾਂ ਜਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਹੋਣ ਲਈ ਆਪਣੀਆਂ ਭੌਤਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਛੋਟੇ ਅਤੇ ਅਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਗਲਾਈਸਰੋਲਿਪਿਡਸ (C16:1 ਅਤੇ C18:1) (19, 20) ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਚੋਣਵੇਂ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖਾਸ ER ਐਗਜ਼ਿਟ ਸਾਈਟਾਂ (ERES) 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ, ਜਿੱਥੇ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਅਤੇ ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਅਧਾਰਿਤ GPI-AP ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਸਮਰਪਿਤ COPII ਵੇਸਿਕਲ (5) ਵਿੱਚ ਗੋਲਗੀ ਵਿੱਚ ਸਹਿ-ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਸੁਪਰ-ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਕਨਫੋਕਲ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (SCLIM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਸ ਲਿਪਿਡ-ਅਧਾਰਿਤ ਵਿਧੀ ਦੀ ਸਿੱਧੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਅਤਿ-ਆਧੁਨਿਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਤਕਨੀਕ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟਲੀ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਨਿਰੀਖਣ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਤਿੰਨ-ਰੰਗੀ ਅਤੇ ਤਿੰਨ-ਅਯਾਮੀ (3D) ਤਸਵੀਰਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਵਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਉੱਚ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਅਤੇ ਗਤੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ (21, 22)।
ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ SCLIM ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਹੋਰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ S. cerevisiae ਵਿੱਚ ER ਛੱਡਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ C26 ਸੀਰਾਮਾਈਡ ਗਰੁੱਪ ਦੇ ਨਾਲ ਆਮ GPI-AP ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਸਕ੍ਰੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ER ਦੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਜੈਨੇਟਿਕ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜੋ ERES ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਲਪਨਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (7, 23)। ਕਾਰਗੋ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ C26 ਸੀਰਾਮਾਈਡ-ਅਧਾਰਤ GPI-AP ਗੈਸ1 ਨੂੰ ਹਰੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (GFP) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮਿਡ2 ਨੂੰ ਨੇੜੇ-ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (iRFP) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਜੋ ਦੋਵੇਂ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ (24-26) ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। sec31-1 ਤਾਪਮਾਨ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਮਿਊਟੈਂਟ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਦੋਵੇਂ ਕਾਰਗੋ ਇੱਕ ਗਲੈਕਟੋਜ਼-ਇੰਡਿਊਸੀਬਲ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸੰਵਿਧਾਨਕ ERES ਮਾਰਕਰ ਦੇ ਅਧੀਨ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਤਾਪਮਾਨ (37°C) 'ਤੇ, ਕਿਉਂਕਿ sec31-1 ਮਿਊਟੇਸ਼ਨ COPII ਕੋਟ ਕੰਪੋਨੈਂਟ Sec31 ਦੇ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ COPII ਉਗਣ ਅਤੇ ER ਨਿਰਯਾਤ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ, ਨਵਾਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ ਕਾਰਗੋ ER (23) 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ (24°C) ਤੱਕ ਠੰਢਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, sec31-1 ਮਿਊਟੈਂਟ ਸੈੱਲ ਸੈਕ੍ਰੇਟਰੀ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਬਰਾਮਦ ਹੋ ਗਏ, ਅਤੇ ਇਕੱਠੇ ਹੋਏ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ER ਤੋਂ ਨਿਰਯਾਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਗਿਆ। CLIM ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ Gas1-GFP ਅਤੇ Mid2-iRFP ਅਜੇ ਵੀ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ sec31-1 ਮਿਊਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ER ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਫਿਰ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 24°C 'ਤੇ ਛੱਡੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1)। ਕਿਉਂਕਿ Mid2-iRFP ਪੂਰੀ ER ਝਿੱਲੀ 'ਤੇ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ Gas1-GFP ਕੇਂਦਰਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਘਨ-ਰਹਿਤ ER ਝਿੱਲੀ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵੰਡ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1, A ਤੋਂ C ਅਤੇ ਮੂਵੀ S1)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 1D ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਵਿੱਚ Mid2-iRFP ਨਹੀਂ ਹੈ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ GPI-AP ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ER ਝਿੱਲੀ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਜਲਦੀ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਕਲੱਸਟਰ ਇੱਕ ਖਾਸ ERES ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਜਿਸਨੂੰ mCherry ਦੇ COPII ਕੋਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ Sec13 (ਚਿੱਤਰ 1, E ਅਤੇ F, ਅਤੇ ਮੂਵੀ S1) (23) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
sec31-1 ਸੈੱਲ ਗਲੈਕਟੋਜ਼-ਪ੍ਰੇਰਿਤ સ્ત્રાવ, ਇੱਕ ਲੰਬੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ (C26) ਸਿਰਾਮਾਈਡ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ਹਰਾ) ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ Mid2-iRFP (TMP, ਨੀਲਾ) ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸ ਰਚਨਾਤਮਕ ERES ਲੇਬਲਿੰਗ Sec13-mCherry (ERES, ਮੈਜੈਂਟਾ) ਨੂੰ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 24°C 'ਤੇ ਭੇਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ SCLIM ਦੁਆਰਾ ਚਿੱਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। (A ਤੋਂ C) ਇੱਕ ਪਲੇਨ (A) ਦੀ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਮਰਜਡ ਜਾਂ ਸਿੰਗਲ 2D ਤਸਵੀਰ, 10 z-ਸੈਕਸ਼ਨਾਂ (B) ਦੀ ਇੱਕ 2D ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ ਤਸਵੀਰ ਜਾਂ ਕਾਰਗੋ ਅਤੇ ERES ਮਾਰਕਰਾਂ (C) ਦੀ ਇੱਕ 3D ਸੈੱਲ ਗੋਲਾਕਾਰ ਤਸਵੀਰ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ 1μm (A ਅਤੇ B)। ਸਕੇਲ ਯੂਨਿਟ 0.551μm (C) ਹੈ। Gas1-GFP ਨੂੰ ਡਿਸਕ੍ਰਿਟ ER ਖੇਤਰਾਂ ਜਾਂ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ Mid2-iRFP ਨੂੰ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ER ਝਿੱਲੀ (C) ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। (D) ਗ੍ਰਾਫ਼ ਚਿੱਟੇ ਤੀਰ ਰੇਖਾ (ਖੱਬੇ) ਦੇ ਨਾਲ Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਵਿੱਚ Gas1-GFP ਅਤੇ Mid2-iRFP ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। AU, ਮਨਮਾਨੀ ਇਕਾਈ। (E ਅਤੇ F) 3D ਚਿੱਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਮਾਲ ਅਤੇ ERES ਚਿੰਨ੍ਹ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ। Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਖਾਸ ERES ਦੇ ਨੇੜੇ ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਨ। ਸਕੇਲ ਯੂਨਿਟ 0.551μm ਹੈ। (F) ਚਿੱਟਾ ਠੋਸ ਤੀਰ ERES ਨਾਲ ਜੁੜੇ Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਵਿਚਕਾਰਲਾ ਅਤੇ ਸੱਜਾ ਪੈਨਲ ਵਿਲੀਨ ਕੀਤਾ ਵੱਡਾ 3D ਚਿੱਤਰ ਅਤੇ ਚੁਣੇ ਹੋਏ Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਦਾ ਇੱਕ ਘੁੰਮਿਆ ਹੋਇਆ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ।
Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ ਅਤੇ ਇੱਕ ਖਾਸ ERES ਵਿਚਕਾਰ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਸਥਾਨਿਕ ਸਬੰਧ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ Gas1-GFP ਚੋਣਵੇਂ ERES ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ER ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਲਈ Mid2-iRFP ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੀ ਗਈ ਚੋਣਤਮਕਤਾ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੈ। ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਸਮਾਨ ਲਈ ERES ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ (ਚਿੱਤਰ 2, A ਤੋਂ C)। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ERES (70%) ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਕਿਸਮ ਦਾ ਕਾਰਗੋ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ 2C ਦੀ ਹੇਠਲੀ ਤਸਵੀਰ ਸਿਰਫ਼ Gas1-GFP (ਚਿੱਤਰ 1) ਜਾਂ ਸਿਰਫ਼ Mid2-iRFP (ਚਿੱਤਰ 2) ਵਾਲੇ ERES ਦੀਆਂ ਦੋ ਆਮ ਉਦਾਹਰਣਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, ਲਗਭਗ 20% ERES ਵਿੱਚ ਦੋ ਕਾਰਗੋ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਇੱਕੋ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਓਵਰਲੈਪ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਕਿ ਕੁਝ ERES (10%) ਵਿੱਚ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਦਾ ਕਾਰਗੋ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ER ਦੇ ਨਿਰਯਾਤ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, GPI-AP Gas1-GFP ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਕਾਰਗੋ Mid2-iRFP ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ERES (ਚਿੱਤਰ 2D) ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਛਾਂਟੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪਿਛਲੇ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (6) ਅਤੇ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਨਿਰਧਾਰਨ (7) ਦੇ ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਇਕਸਾਰ ਹੈ। ਅਸੀਂ ERES (ਚਿੱਤਰ 2E ਅਤੇ ਮੂਵੀ S2) ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਕੁਆਰੰਟੀਨ ਕੀਤੇ ਕਾਰਗੋ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਵੀ ਦੇਖ ਸਕਦੇ ਹਾਂ। ਚਿੱਤਰ 2E ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ Gas1-GFP (ਪੈਨਲ 3) ਜਾਂ Mid2-iRFP (ਪੈਨਲ 4) ਦਾ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਜਿਹਾ ਹਿੱਸਾ ਇੱਕ ਪਾਸੇ ਤੋਂ ERES ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਵੱਖਰੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸੀਮਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ 2E ਦਾ ਪੈਨਲ 5 ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ Gas1-GFP ਅਤੇ Mid2-iRFP ਕਈ ਵਾਰ ਇੱਕੋ ERES ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਉਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਾਸਿਆਂ ਤੋਂ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਵੱਖਰੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦਰਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ COPII ਵੇਸਿਕਲਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਇਹ ਵੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਅਧਾਰਤ GPI-AP Gas1 ਦਾ ਚੋਣਵੇਂ ERES ਵਜੋਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਵੱਖਰਾ ਹੋਣਾ ਅਤੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਖਾਸ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਇੱਕ ਹੋਰ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਸੈਕ੍ਰੇਸ਼ਨ ਕਾਰਗੋ, GFP-ਟੈਗਡ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ Axl2 (27), Mid2-iRFP ਦੇ ਸਮਾਨ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (ਤਸਵੀਰ S1 ਅਤੇ ਮੂਵੀ S3)। ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ Axl2-GFP ਨੂੰ ER ਝਿੱਲੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ Mid2-iRFP (ਚਿੱਤਰ S1, A ਅਤੇ B) ਰਾਹੀਂ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ERES (ਚਿੱਤਰ S1, B ਤੋਂ D) ਵਿੱਚ Mid2-iRFP ਨਾਲ ਸਹਿ-ਸਥਾਨਕੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ 1 ਦੇ ਪੈਨਲ 1 ਅਤੇ 2। S1C ERES ਦੀਆਂ ਦੋ ਆਮ ਉਦਾਹਰਣਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜਿੱਥੇ ਦੋ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਕਾਰਗੋ ਓਵਰਲੈਪ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਦੋਵੇਂ ਸਾਮਾਨ ERES ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S1E, ਪੈਨਲ 3 ਅਤੇ ਮੂਵੀ S3)।
ਸੈਕ31-1 ਸੈੱਲ ਜੋ ਗਲੈਕਟੋਜ਼ ਇਨਡਿਊਸੀਬਲ ਸਕ੍ਰੈਸ਼ਨ, ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ (ਜੀਪੀਆਈ-ਏਪੀ, ਹਰਾ) ਅਤੇ ਮਿਡ2-ਆਈਆਰਐਫਪੀ (ਟੀਐਮਪੀ, ਨੀਲਾ) ਅਤੇ ਸੰਵਿਧਾਨਕ ERES ਲੇਬਲਿੰਗ Sec13-mCherry (ERES, ਮੈਜੈਂਟਾ) ਨੂੰ 37 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। °C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈਕਰੇਸ਼ਨ ਬਲਾਕ ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਲਈ 24 °C 'ਤੇ ਜਾਓ, ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਬਾਅਦ SCLIM ਨਾਲ ਚਿੱਤਰ। (A ਤੋਂ C) ਕਾਰਗੋ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ 2D ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ ਚਿੱਤਰ (A; ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 1μm) ਜਾਂ 3D ਸੈੱਲ ਗੋਲਾਕਾਰ ਚਿੱਤਰ (B ਅਤੇ C; ਸਕੇਲ ਯੂਨਿਟ, 0.456μm) ਅਤੇ ERES ਦੁਆਰਾ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ 10 z-ਸੈਕਸ਼ਨ। (B) ਵਿੱਚ ਹੇਠਲਾ ਪੈਨਲ ਅਤੇ (C) ਵਿੱਚ ਪੈਨਲ ਸਿਰਫ਼ ERES (ਮੈਜੈਂਟਾ) [ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ (ਸਲੇਟੀ) ਅਤੇ ਮਿਡ2-ਆਈਆਰਐਫਪੀ (ਹਲਕਾ ਨੀਲਾ)] ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਸਮਾਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਸੈਸਡ ਚਿੱਤਰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। (C) ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਤੀਰ: ERES ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਹੀ ਕਾਰਗੋ (1 ਤੋਂ 4) ਲੈ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਲੇਟੀ ਤੀਰ: ERES ਵਿੱਚ ਵੱਖਰਾ ਮਾਲ (5) ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਚਿੱਟਾ ਠੋਸ ਤੀਰ: ERES ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਹਿ-ਸਥਿਤ ਮਾਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਹੇਠਾਂ: ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਸਿੰਗਲ ERES ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ Gas1-GFP (1) ਜਾਂ Mid2-iRFP (2) ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 nm। (D) (C) ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਫੋਟੋਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਦੀ ਮਾਤਰਾ। ERES ਦੀ ਔਸਤ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਮਾਲ (Gas1-GFP ਜਾਂ Mid2-iRFP), ਵੱਖਰਾ ਮਾਲ ਅਤੇ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਮਾਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ, 54 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ n=432। ਗਲਤੀ ਬਾਰ = SD। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ। *** P = 0.0002। (E) (C) ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੁਆਰੰਟੀਨ ਕੀਤੇ ਮਾਲ ਦੇ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ERES ਦੀ 3D ਤਸਵੀਰ। Gas1-GFP (ਹਰਾ) (3) ਜਾਂ Mid2-iRFP (ਨੀਲਾ) (4) ਇੱਕ ਪਾਸੇ ਤੋਂ ERES (ਮੈਜੈਂਟਾ) ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ERES ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਖੇਤਰ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਕਈ ਵਾਰ, ਦੋਵੇਂ ਕਿਸਮਾਂ ਦਾ ਮਾਲ ਇੱਕੋ ਪਾਸੇ ਤੋਂ ਇੱਕੋ ERES (5) ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ERES ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਖੇਤਰ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 nm।
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਲੰਬੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ (C26) ਗੈਸ1 ਦੇ ਖਾਸ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਅਤੇ ਛਾਂਟੀ ਨੂੰ ਚੋਣਵੇਂ ERES ਵਿੱਚ ਚਲਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਉਦੇਸ਼ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਖਮੀਰ ਸਟ੍ਰੇਨ GhLag1 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਸਿੰਥੇਸ Lag1 ਅਤੇ Lac1 ਨੂੰ GhLag1 (ਕਪਾਹ ਦਾ Lag1 ਹੋਮੋਲੋਗ) ਨਾਲ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ ਖਮੀਰ ਸਟ੍ਰੇਨ ਇੱਕ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਨਾਲ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਸਟ੍ਰੇਨ ਬਣ ਗਿਆ ਜੋ ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ (ਚਿੱਤਰ 3A) (28) ਨਾਲੋਂ ਛੋਟਾ ਹੈ। ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ, ਕੁੱਲ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ 95% ਬਹੁਤ ਲੰਮਾ (C26) ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ GhLag1 ਵਿੱਚ, ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ 85% ਬਹੁਤ ਲੰਮਾ (C18 ਅਤੇ C16) ਹੈ। ), ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ ਸਿਰਫ 2% ਬਹੁਤ ਲੰਮਾ (C26) ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ C18 ਅਤੇ C16 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੁਣ ਤੱਕ GhLag1 ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਗਏ ਮੁੱਖ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹਨ, MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਇਹ ਵੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ ਕਿ GhLag1 ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ Gas1-GFP ਦੇ GPI ਐਂਕਰ ਵਿੱਚ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਲਿਪਿਡਾਂ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾਯੋਗ ਹੈ। ਗੁਣਵੱਤਾ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3A) (26)। ਇਸ ਲਈ, ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ Cwh43 C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਲਈ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਚੋਣਵਾਂ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 26 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਇਹ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ GhLag1 ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਮਾਤਰਾ ਤੋਂ GPI ਐਂਕਰ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦਾ ਹੈ। S2 (29)। ਫਿਰ ਵੀ, GhLag1 ਦੀ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ C18-C16 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ Gas1-GFP ਵਿੱਚ ਅਜੇ ਵੀ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਤੱਥ ਇਸ ਸਟ੍ਰੇਨ ਨੂੰ ER ਵਿੱਚ ਝਿੱਲੀ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਆਦਰਸ਼ ਸਾਧਨ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਕਲਾਸ ਅਤੇ ਛਾਂਟੀ ਦੀ ਕਾਲਪਨਿਕ ਭੂਮਿਕਾ। ਫਿਰ, ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਰਵਾਇਤੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਰਾਹੀਂ sec31-1 ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਮਿਊਟੈਂਟ ਐਲੀਲ ਨਾਲ GhLag1 ਵਿੱਚ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਵਿੱਚ C26 Gas1-GFP ਦੀ ਇਕੱਤਰ ਹੋਣ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ, ਜਿੱਥੇ ER ਝਿੱਲੀ Ceramide (ਚਿੱਤਰ 3) ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਲੰਬੀ (C18-C16) ਚੇਨ ਮੌਜੂਦ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ sec31-1 ਵਿੱਚ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ sec31-1 GhLag1 ਵਿੱਚ ਲੰਬੀ (C18-C16) ਲੰਬੀ Ceramide ER ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਨਾਲ Gas1-GFP ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੂਰੀ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਕਲੱਸਟਰ ਅਤੇ ਵੰਡਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਹੀ ਹੋਣ ਲਈ, ਕਿਉਂਕਿ C26 ceramide-ਅਧਾਰਿਤ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਖਾਸ ERES (ਚਿੱਤਰ 1) ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਸਬੰਧਤ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਅੱਗੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ਕੀ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ER ਨਿਰਯਾਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿਧੀ ਦਾ ਕਾਰਜ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। GPI-AP ER ਨਿਰਯਾਤ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ COPII ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ GPI ਐਂਕਰ (30, 31) ਦੇ ਗਲਾਈਕਨ ਹਿੱਸੇ ਦੇ Ted1 ਦੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਸਰਗਰਮੀ ਨਾਲ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਹੈ। ਫਿਰ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ GPI-ਗਲਾਈਕਨ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਕਾਰਗੋ ਰੀਸੈਪਟਰ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ Lst1 ਨੂੰ ਚੋਣਵੇਂ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਤੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮੁੱਖ COPII ਕਾਰਗੋ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਬਯੂਨਿਟ Sec24 ਦਾ ਇੱਕ ਖਾਸ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਹੈ, ਇੱਕ GPI-AP-ਅਮੀਰ COPII ਵੇਸਿਕਲਸ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਨ (31-33)। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਡਬਲ ਮਿਊਟੈਂਟ ਬਣਾਇਆ ਜਿਸਨੇ ਇਹਨਾਂ ਸਿੰਗਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ (p24 ਕੰਪਲੈਕਸ ਕੰਪੋਨੈਂਟ Emp24, GPI-ਗਲਾਈਕਨ ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ Ted1 ਅਤੇ ਖਾਸ COPII ਸਬਯੂਨਿਟ Lst1) ਨੂੰ sec31-1 ਮਿਊਟੈਂਟ ਸਟ੍ਰੇਨ ਨਾਲ ਮਿਟਾਉਣ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕੀ Gas1-ਕਲੱਸਟਰ GFP ਬਣਾਉਣਾ ਸੰਭਵ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3)। ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਕਿ sec31-1emp24Δ ਅਤੇ sec31-1ted1Δ ਵਿੱਚ, Gas1-GFP ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਣਕਲੱਸਟਰਡ ਹੈ ਅਤੇ ਪੂਰੇ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ sec31-1 GhLag1 ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ sec31-1lst1Δ ਵਿੱਚ, Gas1-GFP sec31-1 ਵਾਂਗ। ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, Gas1-GFP ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਨੂੰ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਦੀ ਵੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਖਾਸ Lst1 ਭਰਤੀ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਫਿਰ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕੀਤੀ ਕਿ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ Gas1-GFP ਦੇ p24 ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ C18-C16 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ (ਚਿੱਤਰ S3 ਅਤੇ S4, A ਅਤੇ B) ਦੁਆਰਾ ਪੁਨਰਗਠਿਤ GPI-ਗਲਾਈਕਨਾਂ ਜਾਂ GPI-AP ਨਾਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ GPI-AP ਨੂੰ ਨਿਰਯਾਤ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਭਰਤੀ COPII ਉਪ-ਕਿਸਮ Lst1 (ਚਿੱਤਰ S4C)। ਇਸ ਲਈ, C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਨਿਰਭਰ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ER ਨਿਰਯਾਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿਧੀਆਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਪਰ ਲਿਪਿਡ ਲੰਬਾਈ ਦੁਆਰਾ ਸੰਚਾਲਿਤ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਿਕ ਛਾਂਟੀ ਵਿਧੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ, ਅਸੀਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕੀ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ Gas1-GFP ਦੇ ਚੋਣਵੇਂ ERES ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਵਰਗੀਕਰਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ। ਕਿਉਂਕਿ GhLag1 ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਰਟ-ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਵਾਲਾ ਗੈਸ1 ER ਛੱਡਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S5), ਸਾਡਾ ਮੰਨਣਾ ਹੈ ਕਿ ਜੇਕਰ ਛਾਂਟੀ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੁਆਰਾ ਚਲਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ GhLag1 ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਗੈਸ1 ਨੂੰ ਰੀਡਾਇਰੈਕਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪਾਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ERES ਸਮਾਨ ਉਸੇ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ।
(A) GhLag1 ਦੀ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਛੋਟੇ C18-C16 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ Gas1-GFP ਦੇ GPI ਐਂਕਰ ਵਿੱਚ ਅਜੇ ਵੀ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਾਂਗ ਹੀ C26 IPC ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਉੱਪਰ: ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS) ਦੁਆਰਾ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ (Wt) ਅਤੇ GhLag1p ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੇ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਡੇਟਾ ਕੁੱਲ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਔਸਤ। ਗਲਤੀ ਬਾਰ = SD। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ। **** P ＜0.0001। ਹੇਠਲਾ ਪੈਨਲ: ਗੈਸ1-GFP (GPI-IPC) GPI ਐਂਕਰ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ IPC ਦੀ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦਾ MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਅਤੇ GhLag1p ਸਟ੍ਰੇਨ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਡੇਟਾ ਕੁੱਲ IPC ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਪੰਜ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਔਸਤ। ਗਲਤੀ ਬਾਰ = SD। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ। ns, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ। P = 0.9134। (B) ਗਲੈਕਟੋਜ਼-ਪ੍ਰੇਰਿਤ Gas1-GFP ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ਅਤੇ sec31-1lst1Δ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ਼ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ 24°C ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਰੁਟੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਕਰਨ ਲਈ ਭੇਜੇ ਗਏ ਸਨ। ਚਿੱਟਾ ਤੀਰ: ER Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ। ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਤੀਰ: ਅਣਕਲੱਸਟਰਡ ਗੈਸ1-GFP ਪੂਰੀ ER ਝਿੱਲੀ 'ਤੇ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ER ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਰਿੰਗ ਸਟੈਨਿੰਗ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 5μm। (C) (B) ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਫੋਟੋਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ਼ ਦੀ ਮਾਤਰਾ। ਪੰਕਟੇਟ ਗੈਸ1-GFP ਢਾਂਚੇ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਔਸਤ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ। ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ, n≥300 ਸੈੱਲ। ਗਲਤੀ ਬਾਰ = SD। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਬਿਨਾਂ ਜੋੜੀ ਵਾਲਾ t ਟੈਸਟ। **** P ＜0.0001।
ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ GhLag1 ਵਿੱਚ sec31-1 ਤਾਪਮਾਨ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਮਿਊਟੈਂਟ ਐਲੀਲ (ਚਿੱਤਰ 4 ਅਤੇ ਮੂਵੀ S4) ਨਾਲ GhLag1 ਵਿੱਚ Gas1-GFP ਅਤੇ Mid2-iRFP ਦਾ SCLIM ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ। ER ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ ਰੱਖਣ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ 24°C 'ਤੇ ਛੱਡਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ Gas1-GFP ਨੂੰ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਕਲੱਸਟਰ ਅਤੇ ਵੰਡਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਰਵਾਇਤੀ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 4, A ਅਤੇ B)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ERES (67%) ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਵਿੱਚ ਇਸ ਵਿੱਚ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਸਹਿ-ਸਥਿਤ ਕਾਰਗੋ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 4D)। ਚਿੱਤਰ 4C ਦੇ ਪੈਨਲ 1 ਅਤੇ 2 Gas1-GFP ਅਤੇ Mid2-GFP ਨੂੰ ਓਵਰਲੈਪ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ERES ਦੀਆਂ ਦੋ ਆਮ ਉਦਾਹਰਣਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਦੋਵੇਂ ਚੀਜ਼ਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ERES (ਚਿੱਤਰ 4E, ਪੈਨਲ 3 ਅਤੇ ਮੂਵੀ S4) ਵਿੱਚ ਭਰਤੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਲਈ, ਸਾਡੇ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ER ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਕੱਤਰਤਾ ਅਤੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਿਰਧਾਰਕ ਹੈ।
Sec31-1 GhLag1 ਸੈੱਲ ਜੋ ਗਲੈਕਟੋਜ਼-ਪ੍ਰੇਰਿਤ સ્ત્રાવ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ, Gas1-GFP (GPI-AP, ਹਰਾ) ਅਤੇ Mid2-iRFP (TMP, ਨੀਲਾ) ਅਤੇ ਸੰਵਿਧਾਨਕ ERES-ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ Sec13-mCherry (ERES, ਮੈਜੈਂਟਾ) 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਜਾਰੀ ਰੱਖੋ, સ્ત્રાવ ਛੱਡਣ ਲਈ 24°C ਤੱਕ ਡਿੱਗੋ, ਅਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਬਾਅਦ SCLIM ਨਾਲ ਚਿੱਤਰ ਬਣਾਓ। (A ਤੋਂ C) ਕਾਰਗੋ ਅਤੇ ERES ਦੁਆਰਾ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ 10 z-ਸੈਕਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ 2D ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ ਚਿੱਤਰ (A; ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 1μm) ਜਾਂ 3D ਸੈੱਲ ਗੋਲਾਕਾਰ ਚਿੱਤਰ (B ਅਤੇ C; ਸਕੇਲ ਯੂਨਿਟ, 0.45μm)। (B) ਵਿੱਚ ਹੇਠਲਾ ਪੈਨਲ ਅਤੇ (C) ਵਿੱਚ ਪੈਨਲ ਸਿਰਫ਼ ERES (ਮੈਜੈਂਟਾ) [Gas1-GFP (ਸਲੇਟੀ) ਅਤੇ Mid2-iRFP (ਹਲਕਾ ਨੀਲਾ)] ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਸਮਾਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਸੈਸਡ ਚਿੱਤਰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। (C) ਚਿੱਟਾ ਭਰਿਆ ਤੀਰ: ERES, ਮਾਲ ਓਵਰਲੈਪ। ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਤੀਰ: ERES ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਆਈਟਮ ਹੈ। ਹੇਠਲਾ ਪੈਨਲ: ਚੁਣੇ ਹੋਏ ERES ਵਿੱਚ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਸਾਮਾਨ (1 ਅਤੇ 2) (C) ਵਿੱਚ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਹਨ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 nm। (D) (C) ਵਿੱਚ ਦੱਸੇ ਗਏ ਫੋਟੋਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਦੀ ਮਾਤਰਾ। sec31-1 ਅਤੇ sec31-1 GhLag1 ਯੂਨਿਟਾਂ ਵਿੱਚ, ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਕਾਰਗੋ (Gas1-GFP ਜਾਂ Mid2-iRFP) ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਕਾਰਗੋ ਅਤੇ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਕਾਰਗੋ ਲਈ ERES ਦੀ ਔਸਤ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ। ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ, 54 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ n = 432 (sec31-1) ਅਤੇ 47 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ n = 430 (sec31-1 GhLag1)। ਗਲਤੀ ਬਾਰ = SD। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ ਟੈਸਟ। *** P = 0.0002 (sec31-1) ਅਤੇ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) ਚੁਣੇ ਹੋਏ ERES ਦਾ 3D ਚਿੱਤਰ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਕਾਰਗੋ (3) (C) ਵਿੱਚ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਹੈ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ (ਹਰਾ) ਅਤੇ ਮਿਡ2-ਆਈਆਰਐਫਪੀ (ਨੀਲਾ) ਇੱਕੋ ਪਾਸੇ ਤੋਂ ERES (ਮੈਜੈਂਟਾ) ਵੱਲ ਆਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕੋ ERES ਪਾਬੰਦੀਸ਼ੁਦਾ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 ਐਨਐਮ।
ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਵੋ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਲਿਪਿਡ-ਅਧਾਰਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਾਰਗੋ ਨੂੰ ਗੁਪਤ ਮਾਰਗ ਵਿੱਚ ਚੋਣਵੇਂ ਨਿਰਯਾਤ ਸਥਾਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਚੋਣ ਲਈ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦਾ ਹੈ। SCLIM ਨਾਮਕ ਇੱਕ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਅਤੇ ਅਤਿ-ਆਧੁਨਿਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਤਕਨੀਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ ਨਵੇਂ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ (ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਲੰਬੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ (C26) ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਲਿਪਿਡ ਹਿੱਸੇ ਵਾਲੀ ਇੱਕ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ GPI-AP) ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ। ਡਿਸਕ੍ਰਿਟ ER ਵਿੱਚ ਕਲੱਸਟਰ ਕੀਤੇ ਖੇਤਰ ਖਾਸ ERES ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰੇ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਵੰਡੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਸਾਮਾਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ERES ਵਿੱਚ ਚੋਣਵੇਂ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 2)। ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਸੈਲੂਲਰ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ C26 ਤੋਂ C18-C16 ਤੱਕ ਘਟਾ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਕਲੱਸਟਰ ਨੂੰ ਡਿਸਕ੍ਰਿਟ ER ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਵਿਘਨ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਨੂੰ ਉਸੇ ERES (ਚਿੱਤਰ 3 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 3) ਰਾਹੀਂ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ER ਛੱਡਣ ਲਈ ਮੁੜ ਰੂਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। 4)।
ਹਾਲਾਂਕਿ GPI-AP ER ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਨਿਕਲਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਨਿਰਭਰ ਵਿਭਾਜਨ ਵਿਭਿੰਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ ERES ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ (ਚਿੱਤਰ S4 ਅਤੇ S5) ਵੱਲ ਲੈ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਸਾਡੇ ਖੋਜ ਲਿਪਿਡ-ਅਧਾਰਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਕਾਰਗੋਜ਼ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਦੁਆਰਾ ਸੰਚਾਲਿਤ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪਿਕ ਵਰਗੀਕਰਣ ਵਿਧੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਸਾਡੇ ਨਿਰੀਖਣ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇੱਕ ਖਾਸ ERES ਨਾਲ ਜੁੜੇ Gas1-GFP ਖੇਤਰ ਜਾਂ ਕਲੱਸਟਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ Mid2-iRFP ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਨਿਰਭਰ GPI-AP ਕਲੱਸਟਰ ਸੰਬੰਧਿਤ ERES ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਨੂੰ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਬਣਾਏਗਾ, ਅਤੇ ਉਸੇ ਸਮੇਂ, ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢੇਗਾ। સ્ત્રાવ ਇਸ ਖਾਸ ERES ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1 ਅਤੇ 2)। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ C18-C16 ਸੀਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ GPI-AP ਨੂੰ ਖੇਤਰ ਜਾਂ ਕਲੱਸਟਰ ਬਣਾਉਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਨਹੀਂ ਬਣਦੀ, ਇਸ ਲਈ ਉਹ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸੀਕ੍ਰੇਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਉਸੇ ERES ਵਿੱਚ ਬਾਹਰ ਨਹੀਂ ਕੱਢਦੇ ਜਾਂ ਬਦਲਦੇ ਨਹੀਂ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 3 ਅਤੇ 4)। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਖਾਸ ERES ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦੇ ਕੇ ਵੱਖ ਹੋਣ ਅਤੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਇੱਕ ਖਾਸ ER ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਇਸ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਨਿਰਭਰ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਹੈ? ਝਿੱਲੀ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਪਾਸੇ ਤੋਂ ਵੱਖ ਹੋਣ ਦੀ ਪ੍ਰਵਿਰਤੀ GPI-AP ਅਤੇ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਨੂੰ ER ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਵਧੇਰੇ ਅਨਿਯਮਿਤ ਲਿਪਿਡ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਅਤੇ ਤੁਰੰਤ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਲਿਪਿਡ ਬਣਾਉਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਅਤੇ ਅਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਗਲਾਈਸਰੋਲਿਪਿਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਕਲੱਸਟਰ (17, 18)। ਇਹਨਾਂ ਛੋਟੇ ਅਸਥਾਈ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਨੂੰ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ (34) ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਡੇ, ਵਧੇਰੇ ਸਥਿਰ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ C26 Gas1-GFP ਨੂੰ ਵੱਡੇ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣ ਵਾਲੇ ਕਲੱਸਟਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3)। p24 ਕੰਪਲੈਕਸ ਇੱਕ ਹੇਟਰੋਜ਼ਾਈਗਸ ਓਲੀਗੋਮਰ ਹੈ ਜੋ ਖਮੀਰ (35) ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ p24 ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਛੋਟੇ GPI-AP ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਦੇ ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਵੱਡਾ ਸਥਿਰ ਕਲੱਸਟਰ (34) ਪੈਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। GPI-APs ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਐਕਟੋਡੋਮੇਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵੀ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਥਣਧਾਰੀ ਧਰੁਵੀਕ੍ਰਿਤ ਐਪੀਥੈਲਿਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਗੋਲਗੀ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਦੌਰਾਨ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ (36)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜਦੋਂ C18-C16 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ER ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ p24 ਕੰਪਲੈਕਸ Gas1-GFP ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਵੱਡੇ ਵੱਖਰੇ ਕਲੱਸਟਰ ਨਹੀਂ ਬਣਨਗੇ। ਅੰਡਰਲਾਈੰਗ ਵਿਧੀ ਲੰਬੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਖਾਸ ਭੌਤਿਕ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਗੁਣਾਂ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਨਕਲੀ ਝਿੱਲੀਆਂ ਦੇ ਬਾਇਓਫਿਜ਼ੀਕਲ ਅਧਿਐਨ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ ਲੰਬੇ (C24) ਅਤੇ ਛੋਟੇ (C18-C16) ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੋਵੇਂ ਪੜਾਅ ਵੱਖ ਹੋਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਸਿਰਫ ਲੰਬੇ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ (C24) ਫਿਲਮ ਨੂੰ ਮੁੜ ਆਕਾਰ ਦੇਣ ਲਈ ਉੱਚ ਵਕਰ ਅਤੇ ਫਿਲਮ ਝੁਕਣ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਆਪਸੀ ਸੰਦਰਭ ਦੁਆਰਾ (17, 37, 38)। ਇਹ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ TMED2 ਦਾ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬਰੇਨ ਹੈਲਿਕਸ, Emp24 ਦਾ ਮਨੁੱਖੀ ਸਮਰੂਪ, ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਲੋਬੂਲਸ (39) ਵਿੱਚ C18 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਅਧਾਰਤ ਸਫਿੰਗੋਮਾਈਲੀਨ ਨਾਲ ਚੋਣਵੇਂ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਅਣੂ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ (MD) ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ C18 ਅਤੇ C26 ਦੋਵੇਂ ਸਿਰਾਮਾਈਡ Emp24 ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬਰੇਨ ਹੈਲਿਕਸ ਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਲੋਬੂਲਸ ਦੇ ਆਲੇ-ਦੁਆਲੇ ਇਕੱਠੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਸਮਾਨ ਤਰਜੀਹਾਂ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S6)। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ Emp24 ਦਾ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬਰੇਨ ਹੈਲਿਕਸ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਲਿਪਿਡਾਂ ਦੀ ਅਸਮਿਤ ਵੰਡ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਥਣਧਾਰੀ ਸੈੱਲਾਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਨਤੀਜਾ ਹੈ। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ MD ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨ ਈਥਰ ਲਿਪਿਡਾਂ (40) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਵੀ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ER26 ਦੇ ਦੋ ਲੋਬੂਲਸ ਵਿੱਚ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਸਥਾਨਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭਰਪੂਰ ਹੈ। ਜਦੋਂ ਲੂਮਿਨਲ ਲੋਬੂਲਸ ਵਿੱਚ GPI-AP ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ p24 ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਲੋਬੂਲਸ ਵਿੱਚ p24 ਦੇ ਆਲੇ-ਦੁਆਲੇ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ ਇਕੱਠਾ ਹੋਣਾ, ਤਾਂ ਇਹ ਉਂਗਲਾਂ ਰਾਹੀਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇਕੱਤਰਤਾ ਅਤੇ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਵਕਰਤਾ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (41), ਜਿਸ ਨਾਲ GPI-AP ERES ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਵੱਖਰੇ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ER ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਕਰ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦਾ ਵੀ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ (42)। ਪਿਛਲੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਨੇ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਵਿਧੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕੀਤਾ (43, 44)। ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ 'ਤੇ ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਅਧਾਰਤ ਗਲਾਈਕੋਸਫਿੰਗੋਲਿਪਿਡਸ (GSL) ਲਈ ਓਲੀਗੋਲੈਕਟਿਨ, ਜਰਾਸੀਮ ਜਾਂ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਦਾ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵੱਡੇ GSL ਇਕੱਤਰਤਾ ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਪੜਾਅ ਵਿਛੋੜੇ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀਕਰਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ (44)। ਇਵਾਬੂਚੀ ਆਦਿ (43) ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਕਿ ਲੰਬੀਆਂ (C24) ਪਰ ਛੋਟੀਆਂ ਨਹੀਂ (C16) ਐਸੀਲ ਚੇਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, GSL ਲੈਕਟੋਸਿਲਸੇਰਾਮਾਈਡ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਮਲਟੀਵੈਲੈਂਟ ਲਿਗੈਂਡ ਨੇ ਵੱਡੇ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਅਤੇ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਇਨਵੇਜੀਨੇਸ਼ਨ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਲੀਫਲੈਟਸ 'ਤੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਲਿਨ-ਮਾਧਿਅਮ ਸਿਗਨਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਜੋੜੀ ਗਈ ਨਿਊਟ੍ਰੋਫਿਲ ਵਿੱਚ ਐਸੀਲ ਚੇਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਇੰਟਰਡਿਜੀਟੇਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਥਣਧਾਰੀ ਧਰੁਵੀਕ੍ਰਿਤ ਐਪੀਥੈਲਿਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ, ਐਂਟੀ-ਗੋਲਗੀ ਨੈੱਟਵਰਕ (TGN) ਦੀ ਐਪੀਕਲ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਪੱਧਰ ਤੱਕ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ GPI-AP ਦੇ ਵੱਖ ਹੋਣ ਅਤੇ ਛਾਂਟੀ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ (10, 45)। ਇਹ ਇਕੱਤਰਤਾ GPI-AP ਓਲੀਗੋਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (36) ਦੁਆਰਾ ਚਲਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਚੇਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 'ਤੇ ਵੀ ਨਿਰਭਰ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਥਣਧਾਰੀ GPI-AP ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਈਥਰ ਲਿਪਿਡ-ਅਧਾਰਤ ਐਂਕਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਰਸਾਇਣਕ ਬਣਤਰ ਬਹੁਤ ਲੰਬੀ ਐਸੀਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਦੋਵਾਂ ਲਿਪਿਡਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਭੌਤਿਕ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਕ ਗੁਣ ਅਤੇ ਕਾਰਜ (40) ਹਨ। ਇਸ ਲਈ, ਥਣਧਾਰੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਈਥਰ ਲਿਪਿਡ ਹਿੱਸਾ ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਭੂਮਿਕਾ GPI-AP ਇਕੱਤਰਤਾ ਅਤੇ ਛਾਂਟੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਲੰਬੀ-ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਨਾਲ ਜੁੜਨਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਅਜੇ ਵੀ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਖਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਪਿਛਲੀਆਂ ਖੋਜਾਂ ਇਸ ਗੱਲ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ ਗੋਲਗੀ ਬਾਡੀ ਤੱਕ ਲੰਬੀ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਆਵਾਜਾਈ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ, ਪਰ ਇਹ ਖਮੀਰ ਵਰਗੇ GPI ਐਂਕਰਾਂ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਵਿਧੀ ਬਹੁਤ ਲੰਬੀ ਐਸਾਈਲ ਚੇਨ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਅਤੇ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵੇਸਿਕਲ ਵਿੱਚ ਚੋਣਵੇਂ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਹਿ-ਟਰਾਂਸਪੋਰਟ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਜਾਪਦੀ ਹੈ।
ਖਮੀਰ ਅਤੇ ਥਣਧਾਰੀ ਧਰੁਵੀਕ੍ਰਿਤ ਐਪੀਥੈਲਿਅਲ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ, GPI-AP ਇਕੱਠਾ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਹੋਰ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਵੱਖ ਹੋਣਾ, ਇਹ ਸਭ ਸੈੱਲ ਸਤ੍ਹਾ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਪੈਲਾਡੀਨੋ ਅਤੇ ਹੋਰ (48) ਨੇ ਪਾਇਆ ਕਿ ਥਣਧਾਰੀ ਧਰੁਵੀਕ੍ਰਿਤ ਐਪੀਥੈਲਿਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ TGN 'ਤੇ, GPI-AP ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ GPI-APs ਦੇ apical ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਚੋਣਵੇਂ ਵਰਗੀਕਰਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ, ਸਗੋਂ GPI-APs ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ ਸੰਗਠਨ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਜੈਵਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਵੀ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਸੈੱਲ ਸਤ੍ਹਾ। ਖਮੀਰ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ER 'ਤੇ C26 ਸਿਰਾਮਾਈਡ-ਨਿਰਭਰ GPI-AP ਕਲੱਸਟਰ ਪਲਾਜ਼ਮਾ ਝਿੱਲੀ 'ਤੇ GPI-AP ਦੀ ਕਲੱਸਟਰ ਸੰਗਠਨ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (24, 49)। ਇਸ ਮਾਡਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, GhLag1 ਸੈੱਲ GPI ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਜਾਂ ਦਵਾਈਆਂ ਤੋਂ ਐਲਰਜੀ ਵਾਲੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸੈੱਲ ਕੰਧ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦੇ ਹਨ (28), ਅਤੇ ਖਮੀਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਮੇਲ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਜੈਕਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਟਿਪ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ Gas1-GFP ਕਲੱਸਟਰ (49) ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ HLag1 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ G​​ਸੰਭਾਵਿਤ ਸਰੀਰਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। GPI-AP ਗਲਤੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕਰਨਾ ਕਿ ਕੀ ਸੈੱਲ ਸਤਹ ਦੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਸੰਗਠਨ ਨੂੰ ਲਿਪਿਡ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਛਾਂਟੀ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ER ਤੋਂ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਸਾਡੀ ਭਵਿੱਖ ਦੀ ਖੋਜ ਦਾ ਵਿਸ਼ਾ ਹੋਵੇਗਾ।
ਇਸ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ Saccharomyces cerevisiae ਸਟ੍ਰੇਨ ਸਾਰਣੀ S1 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹਨ। ਲਾਈਵ ਸੈੱਲ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ SCLIM ਦੇ MMY1583 ਅਤੇ MMY1635 ਸਟ੍ਰੇਨ W303 ਦੇ ਪਿਛੋਕੜ ਵਿੱਚ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਟੈਗ ਦੇ ਨਾਲ Sec13-mCherry ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਇਹ ਸਟ੍ਰੇਨ ਇੱਕ ਟੈਂਪਲੇਟ (23) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ pFA6a ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (PCR)-ਅਧਾਰਤ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। GAL1 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਹੇਠ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ Mid2-iRFP ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਟ੍ਰੇਨ ਨੂੰ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। pKTiRFP-KAN ਵੈਕਟਰ (E. O'Shea ਦਾ ਤੋਹਫ਼ਾ, ਐਡਜੀਨ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨੰਬਰ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ਖੋਜ ਸਰੋਤ ਪਛਾਣਕਰਤਾ (RRID): Addgene_64687) ਤੋਂ iRFP-KanMx ਕ੍ਰਮ ਦਾ PCR ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤਕਰਨ ਅਤੇ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਮਿਡ2 ਦੇ C-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ। Mid2-iRFP ਜੀਨੋਮ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ GAL1 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਵਿੱਚ ਵਧਾਇਆ ਅਤੇ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇਸਨੂੰ ਏਕੀਕਰਣ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ pRS306 ਦੇ Not I-Sac I ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ pRGS7 ਨੂੰ URA3 ਲੋਕਸ ਵਿੱਚ ਜੋੜਨ ਲਈ Pst I ਨਾਲ ਰੇਖਿਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਫਿਊਜ਼ਨ ਜੀਨ ਸੈਂਟਰੋਮੀਅਰ (CEN) ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਵਿੱਚ GAL1 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਨਿਰਮਾਣ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ pRS416-GAS1-GFP ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ (24) (ਐਲ. ਪੋਪੋਲੋ ਦਾ ਤੋਹਫ਼ਾ) ਤੋਂ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ CEN ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ pBEVY-GL LEU2 (ਸੀ ਦਾ ਤੋਹਫ਼ਾ) ਦੇ Xma I–Xho I ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਿਲਰ; ਐਡਜੀਨ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨੰਬਰ 51225; http://n2t.net/adddene: 51225; RRID: ਐਡਜੀਨ_51225)। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨੂੰ pRGS6 ਨਾਮ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Axl2-GFP ਫਿਊਜ਼ਨ ਜੀਨ ਨੂੰ ਵੀ pBEVY-GL LEU2 ਵੈਕਟਰ ਦੇ GAL1 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਨਿਰਮਾਣ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਹੈ। Axl2-GFP ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ PCR ਦੁਆਰਾ pRS304-p2HSE-Axl2-GFP ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ (23) ਤੋਂ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ pBEVY-GL LEU2 ਵੈਕਟਰ ਦੇ Bam HI-Pst I ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਨੂੰ pRGS12 ਨਾਮ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦਾ ਕ੍ਰਮ ਸਾਰਣੀ S2 ਵਿੱਚ ਸੂਚੀਬੱਧ ਹੈ।
ਇਸ ਸਟ੍ਰੇਨ ਨੂੰ 0.2% ਐਡੀਨਾਈਨ ਅਤੇ 2% ਗਲੂਕੋਜ਼ [YP-ਡੈਕਸਟ੍ਰੋਜ਼ (YPD)], 2% ਰੈਫਿਨੋਜ਼ [YP-ਰੈਫਿਨੋਜ਼] ਅਮੀਰ ਖਮੀਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ p (YP) ਮਾਧਿਅਮ (1% ਖਮੀਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਅਤੇ 2% ਪ੍ਰੋਟੀਨ ept). (YPR)] ਜਾਂ 2% ਗਲੈਕਟੋਜ਼ [YP-ਗਲੈਕਟੋਜ਼ (YPG)] ਨਾਲ ਕਾਰਬਨ ਸਰੋਤ ਵਜੋਂ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਮਾਧਿਅਮ (0.15% ਖਮੀਰ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਅਧਾਰ ਅਤੇ 0.5% ਅਮੋਨੀਅਮ ਸਲਫੇਟ) ਵਿੱਚ ਪੋਸ਼ਣ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਢੁਕਵੇਂ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਅਧਾਰਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਕਾਰਬਨ ਸਰੋਤ ਵਜੋਂ 2% ਗਲੈਕਟੋਜ਼ (ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਗਲੈਕਟੋਜ਼ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਮਾਧਿਅਮ) ਜਾਂ 2% ਗਲੈਕਟੋਜ਼ (ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਗਲੈਕਟੋਜ਼ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਮਾਧਿਅਮ) ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ।
ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ, GAL1 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਅਧੀਨ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਤਾਪਮਾਨ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ sec31-1 ਮਿਊਟੈਂਟ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ YPR ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ 24°C ਤੋਂ ਮੱਧ-ਲੌਗ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਉਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। YPG ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 24°C 'ਤੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ SG ਵਿੱਚ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈਕ੍ਰੇਸ਼ਨ ਬਲਾਕ ਤੋਂ ਛੱਡਣ ਲਈ 24°C 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੋਨਕੈਨਾਵਲਿਨ A ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇੱਕ ਸ਼ੀਸ਼ੇ ਦੀ ਸਲਾਈਡ 'ਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ SCLIM ਦੁਆਰਾ ਚਿੱਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। SCLIM Olympus IX-71 ਇਨਵਰਟਿਡ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਅਤੇ UPlanSApo 100×1.4 ਸੰਖਿਆਤਮਕ ਅਪਰਚਰ ਆਇਲ ਲੈਂਸ (Olympus), ਹਾਈ-ਸਪੀਡ ਅਤੇ ਹਾਈ-ਸਿਗਨਲ-ਟੂ-ਨੌਇਸ ਰੇਸ਼ੋ ਰੋਟੇਟਿੰਗ ਡਿਸਕ ਕਨਫੋਕਲ ਸਕੈਨਰ (ਯੋਕੋਗਾਵਾ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ), ਕਸਟਮ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ, ਅਤੇ ਕਸਟਮ ਕੂਲਿੰਗ ਦਾ ਸੁਮੇਲ ਹੈ। ਸਿਸਟਮ ਦਾ ਇਮੇਜ ਇੰਟੈਂਸੀਫਾਇਰ (ਹਮਾਮਾਤਸੂ ਫੋਟੋਨਿਕਸ) ×266.7 ਦੇ ਅੰਤਮ ਵਿਸਤਾਰ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਵੱਡਦਰਸ਼ੀ ਲੈਂਸ ਸਿਸਟਮ ਅਤੇ ਇੱਕ ਚਾਰਜ-ਕਪਲਡ ਡਿਵਾਈਸ ਕੈਮਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨਾਂ ਨੂੰ ਗੁਣਾ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਹਮਾਮਾਤਸੂ ਫੋਟੋਨਿਕਸ) (21)। ਚਿੱਤਰ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਕਸਟਮ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਯੋਕੋਗਾਵਾ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। 3D ਚਿੱਤਰਾਂ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਉਦੇਸ਼ ਲੈਂਸ ਨੂੰ ਲੰਬਕਾਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਾਈਬ੍ਰੇਟ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕਸਟਮ-ਬਣੇ ਪਾਈਜ਼ੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਐਕਟੁਏਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਟੈਕ ਵਿੱਚ 100 nm ਦੀ ਦੂਰੀ 'ਤੇ ਆਪਟੀਕਲ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ। Z-ਸਟੈਕ ਚਿੱਤਰ ਨੂੰ 3D ਵੌਕਸਲ ਡੇਟਾ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਰੋਟੇਟਿੰਗ ਡਿਸਕ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਿਧਾਂਤਕ ਬਿੰਦੂ ਫੈਲਾਅ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵੋਲੋਸਿਟੀ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਪਰਕਿਨਐਲਮਰ) ਦੁਆਰਾ ਡੀਕਨਵੋਲਿਊਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਹਿ-ਸਥਾਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਲਈ ਵੋਲੋਸਿਟੀ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ, ਕਾਰਗੋ ਸਮੇਤ ERES ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। ਲਾਈਨ ਸਕੈਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਮੈਟਾਮੌਰਫ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸਿਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਦੋ-ਪੂਛ ਵਾਲੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਦੇ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੇ ਆਮ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ANOVA) ਟੈਸਟ ਲਈ, ਸਮੂਹਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰਾਂ ਨੂੰ P <0.05 (*) 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਣ ਵਾਲਾ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਲਈ, ਲੌਗ ਫੇਜ਼ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਵਾਈਪੀਡੀ ਵਿੱਚ ਉਗਾਇਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰਡ ਖਾਰੇ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਅੱਗੇ ਵਧਿਆ ਚੈੱਕ (24)। ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਲਈ ਇੱਕ ਉਦੇਸ਼ ਲੈਂਸ, L5 (GFP) ਫਿਲਟਰ, ਹਮਾਮਾਤਸੂ ਕੈਮਰਾ ਅਤੇ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਸੂਟ X (LAS X) ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਨਾਲ ਲੈਸ ਲੀਕਾ ਡੀਐਮਆਈ8 ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (HCX PL APO 1003/1.40 ਤੇਲ PH3 CS) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ।
ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 65°C 'ਤੇ SDS ਸੈਂਪਲ ਬਫਰ ਨਾਲ ਡੀਨੇਚਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ SDS-ਪੋਲੀਆਕ੍ਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ (PAGE) ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਪ੍ਰਤੀ ਲੇਨ 10 μl ਨਮੂਨਾ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ: 1:3000 ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀ-ਗੈਸ1, 1:500 ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀ-ਐਮਪੀ24, ਅਤੇ 1:3000 ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਖਰਗੋਸ਼ ਪੌਲੀਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਪੀ (ਐਚ. ਰੀਜ਼ਮੈਨ ਵੱਲੋਂ ਇੱਕ ਤੋਹਫ਼ਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਮਾਊਸ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀ-ਪੀਜੀਕੇ1 ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 1:5000 ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਜੇ. ਡੀ ਲਾ ਕਰੂਜ਼ ਵੱਲੋਂ ਇੱਕ ਤੋਹਫ਼ਾ)। ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ: ਹਾਰਸਰੇਡਿਸ਼ ਪੇਰੋਕਸੀਡੇਜ਼ (HRP) ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਬੱਕਰੀ ਐਂਟੀ-ਖਰਗੋਸ਼ ਇਮਯੂਨੋਗਲੋਬੂਲਿਨ G (IgG) 1:3000 (ਪੀਅਰਸ) ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। HRP-ਸੰਯੁਕਤ ਬੱਕਰੀ ਐਂਟੀ-ਮਾਊਸ IgG ਨੂੰ 1:3000 (ਪੀਅਰਸ) ਦੇ ਪਤਲੇਪਣ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਮਿਊਨ ਰਿਸਪਾਂਸ ਜ਼ੋਨ ਨੂੰ ਸੁਪਰਸਿਗਨਲ ਵੈਸਟ ਪਿਕੋ ਰੀਐਜੈਂਟ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੇ ਕੈਮੀਲੂਮਿਨੇਸੈਂਸ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ (31) ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਇੱਕ ਕੁਦਰਤੀ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਅਮੀਰ ER ਫਰੈਕਸ਼ਨ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, TNE ਬਫਰ [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ਅਤੇ protease inhibitor ਮਿਸ਼ਰਣ) ਨਾਲ 600 nm (OD600) 'ਤੇ 100 ਆਪਟੀਕਲ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਦੋ ਵਾਰ ਖਮੀਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਧੋਵੋ। ਇਸਨੂੰ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਤੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈੱਲ ਮਲਬੇ ਅਤੇ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ 17,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ TNE ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਡਿਜੀਟਲਿਸ ਸੈਪੋਨਿਨ ਨੂੰ 1% ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ ਰੋਟੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ 13,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ 4°C 'ਤੇ 60 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਲਈ, ਪਹਿਲਾਂ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਖਾਲੀ ਐਗਰੋਜ਼ ਬੀਡਜ਼ (ਕ੍ਰੋਮੋਟੈਕ) ਨਾਲ 4°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਪ੍ਰੀ-ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ 4°C 'ਤੇ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ GFP-Trap_A (ਕ੍ਰੋਮੋਟੈਕ) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਟਿਡ ਬੀਡਜ਼ ਨੂੰ 0.2% ਡਿਗੌਕਸੀਜੀਨਿਨ ਵਾਲੇ TNE ਨਾਲ ਪੰਜ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, SDS ਸੈਂਪਲ ਬਫਰ ਨਾਲ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, SDS-PAGE 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਇਮਯੂਨੋਬਲੋਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ (31) ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਕਰਾਸ-ਲਿੰਕਿੰਗ ਨਿਰਧਾਰਨ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ER ਅੰਸ਼ 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ER ਅੰਸ਼ ਨੂੰ 0.5 mM ਡਾਇਥੀਓਬਿਸ (ਸਕਸੀਨੀਮਿਡਾਈਲ ਪ੍ਰੋਪੀਓਨੇਟ) (ਪੀਅਰਸ, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਰੌਕਫੋਰਡ, IL, USA; 20°C, 20 ਮਿੰਟ) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗਲਾਈਸੀਨ (50 mM ਅੰਤਿਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ, 5 ਮਿੰਟ, 20°C) ਜੋੜ ਕੇ ਕਰਾਸਲਿੰਕਿੰਗ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਬੁਝਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (50), ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਅਤੇ GhLag1 ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦਾ MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ YPD ਵਿੱਚ 30°C 'ਤੇ ਘਾਤਕ ਪੜਾਅ (3 ਤੋਂ 4 OD600 ਯੂਨਿਟ/ml) ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ 25×107 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕਟਾਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਈਕਲੋਰੋਐਸੇਟਿਕ ਐਸਿਡ ਨਾਲ ਬੁਝਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਘੋਲਕ [ਈਥੇਨੌਲ, ਪਾਣੀ, ਈਥਰ, ਪਾਈਰੀਡੀਨ ਅਤੇ 4.2 N ਅਮੋਨੀਅਮ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਡ (15:15:5:1:0.018 v/v)] ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਮਿਆਰੀ C17 ਸਿਰਾਮਾਈਡ (860517, ਅਵੰਤੀ ਪੋਲਰ ਲਿਪਿਡ) ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ 1.2 nmol ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇ ਹਲਕੇ ਖਾਰੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਇਸਿਸ ਕਰਨ ਲਈ ਮੋਨੋਮੇਥਾਈਲਾਮਾਈਨ ਰੀਐਜੈਂਟ [ਮੀਥੇਨੌਲ, ਪਾਣੀ, n-ਬਿਊਟਾਨੋਲ ਅਤੇ ਮਿਥਾਈਲਾਮਾਈਨ ਘੋਲ (4:3:1:5 v/v)] ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਡੀਸਾਲਟ ਲਈ ਪਾਣੀ-ਸੰਤ੍ਰਪਤ n-ਬਿਊਟਾਨੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਮੋਡ ਘੋਲਕ [ਕਲੋਰੋਫਾਰਮ/ਮੀਥੇਨੌਲ/ਪਾਣੀ (2:7:1) + 5 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਐਸੀਟੇਟ] ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ। ਸਫਿੰਗੋਲਿਪਿਡ ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਮਲਟੀ-ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਨਿਗਰਾਨੀ (MRM) ਕੀਤੀ ਗਈ। TSQ ਵੈਂਟੇਜ ਟਰਸ਼ਰੀ ਕੁਆਡ੍ਰਪੋਲ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਲਿਪਿਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਰੋਬੋਟਿਕ ਨੈਨੋਫਲੋ ਆਇਨ ਸਰੋਤ ਨੈਨੋਮੇਟ HD (ਐਡਵਿਅਨ ਬਾਇਓਸਾਇੰਸ, ਇਥਾਕਾ, NY) ਨਾਲ ਲੈਸ ਹੈ। ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ ਹਰੇਕ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਹੈ। MS ਡੇਟਾ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ, ਲਿਪਿਡ ਸਿਗਨਲ ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਮਾਪਾਂ ਦਾ ਮੱਧਮਾਨ ਹੈ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ (31) ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲ (800×107) ਕੁਦਰਤੀ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧੀਨ ਸਨ। ਸ਼ੁੱਧ ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਨੂੰ ਐਸਡੀਐਸ-ਪੇਜ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਪੌਲੀਵਿਨਾਇਲਾਈਡੀਨ ਫਲੋਰਾਈਡ (ਪੀਵੀਡੀਐਫ) ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਐਮਾਈਡ ਕਾਲੇ ਨਾਲ ਪੀਵੀਡੀਐਫ ਨੂੰ ਰੰਗ ਕੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਬੈਂਡ ਨੂੰ ਪੀਵੀਡੀਐਫ ਤੋਂ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 5 ਵਾਰ ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਾਲ ਅਤੇ ਇੱਕ ਵਾਰ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ-ਐਮਐਸ (ਐਲਸੀ-ਐਮਐਸ) ਗ੍ਰੇਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਪੱਟੀ ਨੂੰ 500μl 0.3 ਐਮ NaOAc (pH 4.0), ਬਫਰ ਅਤੇ 500μl ਤਾਜ਼ੇ ਘੁਲੇ ਹੋਏ 1 ਐਮ ਸੋਡੀਅਮ ਨਾਈਟ੍ਰਾਈਟ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨਾਲ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਕੇ, ਲਿਪਿਡ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਤੋਂ ਛੱਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਗਲੂਕੋਸਾਮਾਈਨ ਅਤੇ ਇਨੋਸਾਈਟੋਲ (51) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇਨੋਸਾਈਨ ਫਾਸਫੇਟ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਦੀ ਰਿਹਾਈ ਨੂੰ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਝਿੱਲੀ ਪੱਟੀ ਨੂੰ LC-MS ਗ੍ਰੇਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਚਾਰ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਸੁੱਕਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੱਕ -80°C 'ਤੇ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਵਾਯੂਮੰਡਲ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ PVDF ਝਿੱਲੀ ਦਾ ਇੱਕ ਖਾਲੀ ਨਮੂਨਾ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ। Gas1-GFP ਤੋਂ ਕੱਢੇ ਗਏ ਲਿਪਿਡ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਫਿਰ MS ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਨ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (50)। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, GPI-ਲਿਪਿਡ ਵਾਲੀਆਂ PVDF ਪੱਟੀਆਂ ਨੂੰ 75μl ਨੈਗੇਟਿਵ ਮੋਲਡ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ [ਕਲੋਰੋਫਾਰਮ/ਮੀਥੇਨੌਲ (1:2) + 5 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਐਸੀਟੇਟ] ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਫਿੰਗੋਲਿਪਿਡ ਸਪੀਸੀਜ਼ (TSQ ਵੈਂਟੇਜ) ਦੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (ESI)-MRM/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਪਾਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਇਸ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, MS ਡੇਟਾ ਨੈਗੇਟਿਵ ਆਇਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, GPI ਐਂਕਰ ਦੇ ਲਿਪਿਡ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ [3H]-inositol-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ GPI-AP (16) ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਲਿਪਿਡਾਂ ਨੂੰ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਸਿਸਟਮ (55:45:10 ਕਲੋਰੋਫਾਰਮ-ਮੀਥੇਨੌਲ-0.25% KCl) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਤਲੀ-ਪਰਤ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ FLA-7000 (Fujifilm) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ (600×107) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਟੀਐਨਈ ਬਫਰ ਨਾਲ ਦੋ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਤੋੜਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈੱਲ ਮਲਬੇ ਅਤੇ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਫਿਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 17,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਗੋਲੀ ਨੂੰ ਟੀਐਨਈ ਵਿੱਚ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 0.2% ਡਿਜੀਟਲਿਸ ਸੈਪੋਨਿਨ ਵਾਲੇ ਟੀਐਨਈ ਵਿੱਚ 1 ਯੂ ਪੀਆਈ-ਪੀਐਲਸੀ (ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ 17,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ 4°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਨੂੰ ਇਮਯੂਨੋਪ੍ਰੀਸੀਪੀਟੇਟ ਕਰਨ ਲਈ, ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ GFP-Trap_A (ChromoTek) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤੇ ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਨੂੰ ਕੂਮਾਸੀ ਬ੍ਰਿਲਿਅੰਟ ਨੀਲੇ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਗੈਸ1-ਜੀਐਫਪੀ ਸਟੈਨਿੰਗ ਬੈਂਡ ਨੂੰ ਐਕਵੇਡਕਟ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਸਲੇਟੀ ਤੋਂ ਕੱਟ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਆਇਓਡੋਐਸੀਟਾਮਾਈਡ ਨਾਲ ਅਲਕਾਈਲੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਡਾਇਥੀਓਥ੍ਰੀਟੋਲ ਨਾਲ ਕਟੌਤੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਨਾਲ ਇਨ-ਜੈੱਲ ਪਾਚਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟ੍ਰਾਈਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਜੀਪੀਆਈ-ਗਲਾਈਕੈਨ ਨਾਲ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰੋ ਅਤੇ ਸੁਕਾਓ। ਸੁੱਕੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ 20 μl ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੋਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਹਿੱਸਾ (8μl) LC ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਓ। ਇੱਕ ਓਕਟਾਡੇਸੀਲਸੀਲੇਨ (ODS) ਕਾਲਮ (Develosil 300ODS-HG-5; ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ 150 mm×1.0 mm; ਨੋਮੁਰਾ ਕੈਮੀਕਲ, ਆਈਚੀ ਪ੍ਰੀਫੈਕਚਰ, ਜਾਪਾਨ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਖਾਸ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਮੋਬਾਈਲ ਪੜਾਅ ਘੋਲਕ A (0.08% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਅਤੇ ਘੋਲਕ B (80% ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ ਵਿੱਚ 0.15% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਹੈ। ਇੱਕ ਐਕਸੇਲਾ ਐਚਪੀਐਲਸੀ ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਬੋਸਟਨ, ਮੈਸੇਚਿਉਸੇਟਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ 55 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਘੋਲਕ A ਨਾਲ ਕਾਲਮ ਨੂੰ 50 μl ਮਿੰਟ-1 ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ ਨਾਲ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਐਲੂਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਘੋਲਕ B ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ 40% ਤੱਕ ਵਧਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। , ਸੰਯੁਕਤ ਰਾਜ ਅਮਰੀਕਾ)। ਐਲੂਏਟ ਨੂੰ ਲਗਾਤਾਰ ESI ਆਇਨ ਸਰੋਤ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਈਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ GPI-ਗਲਾਈਕੈਨ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ LTQ ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ XL (ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਲੀਨੀਅਰ ਆਇਨ ਟ੍ਰੈਪ-ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ; ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MS ਸੈੱਟਅੱਪ ਵਿੱਚ, ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਸਰੋਤ ਦੀ ਵੋਲਟੇਜ 4.5 kV 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 300°C 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਵੋਲਟੇਜ ਅਤੇ ਟਿਊਬ ਲੈਂਸ ਵੋਲਟੇਜ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 15 V ਅਤੇ 50 V 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। MS ਡੇਟਾ 300/m/z ਪੁੰਜ/ਚਾਰਜ ਅਨੁਪਾਤ (m/z) 3000 ਦੀ ਪੁੰਜ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਆਇਨ ਮੋਡ (60,000 ਦਾ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ; ਪ੍ਰਤੀ ਮਿਲੀਅਨ 10 ਹਿੱਸੇ ਦੀ ਪੁੰਜ ਸ਼ੁੱਧਤਾ) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। MS/MS ਡੇਟਾ LTQ ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ XL [ਪਹਿਲੇ 3 ਅੰਕ ਜਿਨ੍ਹਾਂ 'ਤੇ ਡੇਟਾ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਟੱਕਰ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਵਿਛੋੜਾ (CID)] ਵਿੱਚ ਆਇਨ ਟ੍ਰੈਪ ਰਾਹੀਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
MD ਸਿਮੂਲੇਸ਼ਨ GROMACS (52) ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਅਤੇ MARTINI 2 ਫੋਰਸ ਫੀਲਡ (53-55) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਫਿਰ CHARMM GUI ਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਬਿਲਡਰ (56, 57) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਡਾਇਓਲੀਓਇਲਫੋਸਫੇਟਿਡਿਲਕੋਲੀਨ (DOPC) ਅਤੇ Cer C18 ਜਾਂ DOPC ਅਤੇ Cer C26 ਵਾਲੀ ਇੱਕ ਬਾਇਲੇਅਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। Cer C26 ਦੀ ਟੌਪੋਲੋਜੀ ਅਤੇ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ DXCE ਤੋਂ ਸਫਿੰਗੋਸਾਈਨ ਟੇਲ ਤੋਂ ਵਾਧੂ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਡਬਲ ਲੇਅਰ ਨੂੰ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਚਲਾਉਣ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਦੱਸੀ ਗਈ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਫਿਰ Emp24 ਵਾਲਾ ਸਿਸਟਮ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਸਿਸਟਮ ਦੇ ਆਖਰੀ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਖਮੀਰ Emp24 (ਅਵਸ਼ੇਸ਼ 173 ਤੋਂ 193) ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਮਬ੍ਰੇਨ ਡੋਮੇਨ ਨੂੰ ਵਿਜ਼ੂਅਲ MD (VMD) ਟੂਲ ਅਣੂ ਬਣਤਰ (58) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ α-ਹੈਲਿਕਸ ਵਜੋਂ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ, ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਲਿਪਿਡਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਮੋਟੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦਾਣੇਦਾਰ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ CHARMM GUI ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਬਾਇਲੇਅਰ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਅੰਤਿਮ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ 1202 DOPC ਅਤੇ 302 Cer C26 ਜਾਂ 1197 DOPC ਅਤੇ 295 Cer C18 ਅਤੇ Emp24 ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ 0.150M ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੱਕ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ ਕਰੋ। ਦੋ ਬਾਇਲੇਅਰ ਰਚਨਾਵਾਂ ਲਈ ਚਾਰ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਬਣਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ।
ਲਿਪਿਡ ਬਾਇਲੇਅਰ ਨੂੰ CHARMM GUI ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 405,000 ਕਦਮਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰਨਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਸਥਿਤੀ ਦੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਘਟਾਇਆ ਅਤੇ ਖਤਮ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਮਾਂ ਕਦਮ 0.005 ps ਤੋਂ 0.02 ps ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸੰਤੁਲਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ 0.02 ps ਦੇ ਸਮੇਂ ਪੜਾਅ ਨਾਲ 6 µs ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। Emp24 ਪਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਅਤੇ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਉਸੇ CHARMM GUI ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਉਤਪਾਦਨ ਵਿੱਚ 8 ਸਕਿੰਟ ਲਈ ਚਲਾਓ।
ਸਾਰੇ ਸਿਸਟਮਾਂ ਲਈ, ਸੰਤੁਲਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ, ਦਬਾਅ ਨੂੰ ਬੇਰੇਂਡਸਨ ਬੈਰੋਸਟੈਟ (59) ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਉਤਪਾਦਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ, ਦਬਾਅ ਨੂੰ ਪੈਰੀਨੇਲੋ-ਰਹਿਮਾਨ ਬੈਰੋਸਟੈਟ (60) ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਔਸਤ ਦਬਾਅ 1 ਬਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਅਰਧ-ਆਈਸੋਟ੍ਰੋਪਿਕ ਦਬਾਅ ਜੋੜਨ ਵਾਲੀ ਯੋਜਨਾ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸੰਤੁਲਨ ਅਤੇ ਉਤਪਾਦਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਸਪੀਡ ਰੀਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਥਰਮੋਸਟੈਟ (61) ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਕਣਾਂ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪੂਰੇ ਕਾਰਜ ਦੌਰਾਨ, ਟੀਚਾ ਤਾਪਮਾਨ 310K ਹੈ। ਗੈਰ-ਬੰਧਨ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਗਣਨਾ 0.005 ਬਫਰ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਵਰਲੇਟ ਸਕੀਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਜੋੜੀ ਸੂਚੀ ਤਿਆਰ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਕੁਲੌਂਬ ਸ਼ਬਦ ਦੀ ਗਣਨਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਖੇਤਰ ਅਤੇ 1.1 nm ਦੀ ਕੱਟ-ਆਫ ਦੂਰੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਵੈਂਡਰ ਵਾਲਸ ਸ਼ਬਦ 1.1 nm ਦੀ ਕੱਟ-ਆਫ ਦੂਰੀ ਵਾਲੀ ਇੱਕ ਕੱਟ-ਆਫ ਸਕੀਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਵਰਲੇਟ ਕੱਟ-ਆਫ ਸਕੀਮ ਸੰਭਾਵੀ ਡ੍ਰਿਫਟ (62) ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
VMD ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, DOPC ਫਾਸਫੇਟ ਬੀਡਸ ਜਾਂ ਸਿਰਾਮਾਈਡ AM1 ਬੀਡਸ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿਚਕਾਰ ਕੱਟਆਫ ਵੇਵਲੈਂਥ 0.7 nm ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਣ ਵਾਲੇ ਲਿਪਿਡਸ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, (63) ਵਿੱਚ ਡਿਪਲੇਸ਼ਨ-ਐਨਰਚਮੈਂਟ (DE) ਫੈਕਟਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ: DE ਫੈਕਟਰ = (ਪ੍ਰੋਟੀਨ 0.7 ਵਿੱਚ ਕੁੱਲ ਲਿਪਿਡਸ ਦੀ ਮਾਤਰਾ) ਪ੍ਰੋਟੀਨ 0.7 ਵਿੱਚ (ਕੁੱਲ ਲਿਪਿਡਸ ਵਿੱਚ Cer ਦੀ ਮਾਤਰਾ)
ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤਾ ਮੁੱਲ ਔਸਤ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਗਲਤੀ ਬਾਰ SE ਦੀਆਂ ਚਾਰ ਸੁਤੰਤਰ ਕਾਪੀਆਂ ਹਨ। DE ਫੈਕਟਰ ਦੀ ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਮਹੱਤਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ t ਟੈਸਟ [(averageDE-factor-1)/SE] ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਇੱਕ-ਪੂਛ ਵਾਲੀ ਵੰਡ ਤੋਂ P ਮੁੱਲ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ।
GROMACS ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਟਰੇਸ ਦੇ ਆਖਰੀ 250 ns ਦੇ ਅੰਦਰ Emp24 ਵਾਲੇ ਸਿਸਟਮ ਦੇ 2D ਲੇਟਰਲ ਡੈਨਸਿਟੀ ਮੈਪ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੇਰਾਮਾਈਡ ਦੇ ਸੰਸ਼ੋਧਨ/ਘਾਟ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, Cer ਦੇ ਘਣਤਾ ਮੈਪ ਨੂੰ Cer ਅਤੇ DOPC ਦੇ ਨਕਸ਼ੇ ਦੇ ਜੋੜ ਨਾਲ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ Cer ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਾਲ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਉਹੀ ਰੰਗ ਦਾ ਮੈਪ ਸਕੇਲ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਲੇਖ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ਵੇਖੋ।
ਇਹ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਪਹੁੰਚ ਵਾਲਾ ਲੇਖ ਹੈ ਜੋ ਕਰੀਏਟਿਵ ਕਾਮਨਜ਼ ਐਟ੍ਰਬਿਊਸ਼ਨ-ਗੈਰ-ਵਪਾਰਕ ਲਾਇਸੈਂਸ ਦੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਧੀਨ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿਸੇ ਵੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਵਰਤੋਂ, ਵੰਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਅੰਤਿਮ ਵਰਤੋਂ ਵਪਾਰਕ ਲਾਭ ਲਈ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਆਧਾਰ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ ਕੰਮ ਸਹੀ ਹੈ। ਹਵਾਲਾ।
ਨੋਟ: ਅਸੀਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਆਪਣਾ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਦੇਣ ਲਈ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ ਤਾਂ ਜੋ ਜਿਸ ਵਿਅਕਤੀ ਨੂੰ ਤੁਸੀਂ ਪੰਨੇ 'ਤੇ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹੋ ਉਸਨੂੰ ਪਤਾ ਲੱਗੇ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ ਕਿ ਉਹ ਈਮੇਲ ਦੇਖੇ ਅਤੇ ਇਹ ਸਪੈਮ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕੋਈ ਵੀ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕਰਾਂਗੇ।
ਇਹ ਸਵਾਲ ਇਹ ਜਾਂਚਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਵਿਜ਼ਟਰ ਹੋ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸਪੈਮ ਸਬਮਿਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ।
ਸੋਫੀਆ ਰੌਡਰਿਗਜ਼-ਗੈਲਾਰਡੋ, ਕਾਜ਼ੂਓ ਕੁਰੋਕਾਵਾ, ਸੁਸਾਨਾ ਸਬੀਡੋ-ਬੋਜ਼ੋ, ਅਲੇਜੈਂਡਰੋ ਕੋਰਟੇਜ਼ · ਗੋਮੇਜ਼ (ਅਲੇਜੈਂਡਰੋ ਕੋਰਟੇਸ-ਗੋਮੇਜ਼), ਅਤਸੁਕੋ ਇਕੇਦਾ (ਅਤਸੁਕੋ ਇਕੇਦਾ), ਵਲੇਰੀਆ ਜ਼ੋਨੀ (ਵੈਲੇਰੀਆ ਜ਼ੋਨੀ), ਔਕਸੀਲਿਆਡੋਰਾ ਐਗੁਏਲੇਰਾ-ਰੋਮੇਰੋ, ਅਨਾਲੋਜੀ ਸੇਰਰੋਜੀਓ (ਲੋਏਜੈਂਡਰੋ-ਰੋਮੇਰੋ, ਅਨਾਲੋਜੀ, ਅਨਾਰੋਗੀ) ਲੋਪੇਜ਼), ਮਿਹੋ ਵਾਗਾ (ਮਿਹੋ ਵਾਗਾ), ਮਿਸਾਕੋ ਅਰਮਾਨ (ਮਿਸਾਕੋ ਅਰਮਾਨ), ਮੀਆਕੋ ਰਿਮਨ (ਮਿਆਕੋ ਰਿਮਨ), ਪ੍ਰੋ ਅਕੀਰਾ, ਸਟੇਫਾਨੋ ਫੈਨੀ, ਅਕੀਹੀਕੋ ਨਾਕਾਨੋ, ਮੈਨੁਅਲ ਮੁਨੀਜ਼
3D ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਚੋਣਵੇਂ ਆਉਟਪੁੱਟ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਛਾਂਟੀ ਲਈ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
ਸੋਫੀਆ ਰੌਡਰਿਗਜ਼-ਗੈਲਾਰਡੋ, ਕਾਜ਼ੂਓ ਕੁਰੋਕਾਵਾ, ਸੁਸਾਨਾ ਸਬੀਡੋ-ਬੋਜ਼ੋ, ਅਲੇਜੈਂਡਰੋ ਕੋਰਟੇਜ਼ · ਗੋਮੇਜ਼ (ਅਲੇਜੈਂਡਰੋ ਕੋਰਟੇਸ-ਗੋਮੇਜ਼), ਅਤਸੁਕੋ ਇਕੇਦਾ (ਅਤਸੁਕੋ ਇਕੇਦਾ), ਵਲੇਰੀਆ ਜ਼ੋਨੀ (ਵੈਲੇਰੀਆ ਜ਼ੋਨੀ), ਔਕਸੀਲਿਆਡੋਰਾ ਐਗੁਏਲੇਰਾ-ਰੋਮੇਰੋ, ਅਨਾਲੋਜੀ ਸੇਰਰੋਜੀਓ (ਲੋਏਜੈਂਡਰੋ-ਰੋਮੇਰੋ, ਅਨਾਲੋਜੀ, ਅਨਾਰੋਗੀ) ਲੋਪੇਜ਼), ਮਿਹੋ ਵਾਗਾ (ਮਿਹੋ ਵਾਗਾ), ਮਿਸਾਕੋ ਅਰਮਾਨ (ਮਿਸਾਕੋ ਅਰਮਾਨ), ਮੀਆਕੋ ਰਿਮਨ (ਮਿਆਕੋ ਰਿਮਨ), ਪ੍ਰੋ ਅਕੀਰਾ, ਸਟੇਫਾਨੋ ਫੈਨੀ, ਅਕੀਹੀਕੋ ਨਾਕਾਨੋ, ਮੈਨੁਅਲ ਮੁਨੀਜ਼
3D ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਚੋਣਵੇਂ ਆਉਟਪੁੱਟ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਛਾਂਟੀ ਲਈ ਸਿਰਾਮਾਈਡ ਚੇਨ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
©2020 ਅਮੈਰੀਕਨ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਫਾਰ ਦ ਐਡਵਾਂਸਮੈਂਟ ਆਫ਼ ਸਾਇੰਸ। ਸਾਰੇ ਹੱਕ ਰਾਖਵੇਂ ਹਨ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ਅਤੇ COUNTER ਦਾ ਭਾਈਵਾਲ ਹੈ। ਸਾਇੰਸ ਐਡਵਾਂਸ ISSN 2375-2548।