ਮੌਜੂਦਾ *ਮੌਜੂਦਾ ਪਤਾ: ਕੋਲੋਨ 50931, ਜਰਮਨੀ, ਕੋਲੋਨ ਐਕਸੀਲੈਂਸ ਕਲੱਸਟਰ ਰਿਸਰਚ ਆਨ ਸੈਲੂਲਰ ਸਟ੍ਰੈਸ ਰਿਸਪਾਂਸ ਇਨ ਏਜਿੰਗ-ਸਬੰਧਤ ਬਿਮਾਰੀਆਂ (CECAD)।
ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਅਟੱਲ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪਲਾਸਟਿਕਿਟੀ ਸੀਮਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੀ ਸੈੱਲ ਖੁਦਮੁਖਤਿਆਰੀ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਸਮਝਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਸੈੱਲ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਤੀਸ਼ੀਲ OXPHOS ਘਾਟ ਦੇ ਨਾਲ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜੋ ਵਿਘਨ ਵਾਲੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਨੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਦੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਡੂੰਘਾ ਬਦਲਾਅ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸਹੀ ਪਾਚਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਾਂ ਦੀ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਹੋਈ। ਅਚਾਨਕ, ਅਸੀਂ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਕਾਰਬੋਕਸਾਈਲੇਜ਼ (PCx) ਅਤੇ ਹੋਰ ਐਂਟੀ-ਏਜਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦਾ ਸਪੱਸ਼ਟ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜੋ TCA ਚੱਕਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰਲੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਕਰਦੇ ਹਨ। PCx ਦੀ ਰੋਕਥਾਮ ਨੇ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਤਣਾਅ ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧਾ ਦਿੱਤਾ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਦਾ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਆ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਡੀਜਨਰੇਟ ਕੀਤੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫਿਊਜ਼ਨ ਦੀ ਬਹਾਲੀ ਇਹਨਾਂ ਪਾਚਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉਲਟਾ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ। ਸਾਡੀਆਂ ਖੋਜਾਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਣਜਾਣ ਮਾਰਗਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਨੂੰ ਲਚਕੀਲਾਪਣ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਆਖਰੀ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਉਲਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਨਿਊਰੋਨਲ ਊਰਜਾ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੀ ਕੇਂਦਰੀ ਭੂਮਿਕਾ ਮਨੁੱਖੀ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਵਿਆਪਕ ਨਿਊਰੋਲੋਜੀਕਲ ਲੱਛਣਾਂ ਦੁਆਰਾ ਜ਼ੋਰ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਜੀਨ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ (1, 2) ਜਾਂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਜੀਨ ਵਿਨਾਸ਼, ਜੋ ਅਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਡੀਐਨਏ (mtDNA) (3, 4) ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ, ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਪਾਚਕ ਮਾਰਗ (5-7) ਨੂੰ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇਹਨਾਂ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਰੋਗਜਨਨ ਦੀ ਡੂੰਘਾਈ ਨਾਲ ਸਮਝ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਬਿਲਕੁਲ ਉਲਟ, ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ (ATP) ਉਤਪਾਦਨ ਦੀ ਆਮ ਅਸਫਲਤਾ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਖਾਸ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਪਾਚਕ ਪਰਿਵਰਤਨਾਂ ਬਾਰੇ ਸਾਡੀ ਸਮਝ ਬੁਨਿਆਦੀ ਹੈ (8), ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਬਿਮਾਰੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਜਾਂ ਰੋਕਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕੋ (9)। ਜਾਣਕਾਰੀ ਦੀ ਘਾਟ ਇਹ ਤੱਥ ਹੈ ਕਿ ਨਰਵ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਦੀਆਂ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਬਹੁਤ ਸੀਮਤ ਪਾਚਕ ਲਚਕਤਾ ਵਾਲਾ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (10)। ਇਹ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਇਹ ਸੈੱਲ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸੱਟ ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦਾ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਲਈ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦੀ ਸਪਲਾਈ ਦੇ ਤਾਲਮੇਲ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦਰੀ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਦੀਆਂ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਲਗਭਗ ਗਲਾਈਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਹੈ (11-14)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਦੀ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੈਲੂਲਰ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਖਾਸ ਨਿਊਰੋਨਲ ਉਪ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਪਾਚਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਰੁਕਾਵਟ ਪਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਸਹੀ ਸੈਲੂਲਰ ਅਤੇ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਬਾਰੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਪਾਚਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਬਾਹਰੀ ਝਿੱਲੀ ਫਿਊਜ਼ਨ (Mfn2) ਦੇ ਵਿਨਾਸ਼ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਨਿਊਰੋਨਸ (PNs) ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕੀਤਾ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ Mfn2 ਪਰਿਵਰਤਨ ਚਾਰਕੋਟ-ਮੈਰੀ-ਟੂਥ ਟਾਈਪ 2A (15) ਵਜੋਂ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਵਿਰਾਸਤੀ ਮੋਟਰ ਸੰਵੇਦੀ ਨਿਊਰੋਪੈਥੀ ਦੇ ਇੱਕ ਰੂਪ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ, ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ Mfn2 ਦਾ ਸ਼ਰਤੀਆ ਵਿਨਾਸ਼ ਆਕਸੀਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਹੈ। ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ (OXPHOS) ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਵਿਧੀ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਨਿਊਰੋਨਲ ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ (16-19) ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਟਿਵ ਫੀਨੋਟਾਈਪ ਪ੍ਰਗਤੀਸ਼ੀਲ ਨਿਊਰੋਲੋਜੀਕਲ ਲੱਛਣਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅੰਦੋਲਨ ਵਿਕਾਰ (18, 19) ਜਾਂ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਅਟੈਕਸੀਆ (16)। ਲੇਬਲ-ਮੁਕਤ ਮਾਤਰਾਤਮਕ (LFQ) ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ, ਮੈਟਾਬੋਲੌਮਿਕਸ, ਇਮੇਜਿੰਗ, ਅਤੇ ਵਾਇਰੋਲੋਜੀਕਲ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪ੍ਰਗਤੀਸ਼ੀਲ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਕਾਰਬੋਕਸਾਈਲੇਜ਼ (PCx) ਅਤੇ ਹੋਰ ਕਾਰਕਾਂ ਨੂੰ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਕਿ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ PNs ਦੇ ਆਰਟੀਰੀਓਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਇਸ ਖੋਜ ਦੀ ਸਾਰਥਕਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ Mfn2-ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ PCx ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਘੱਟ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਪਾਇਆ ਕਿ ਇਸ ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਨੇ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਤਣਾਅ ਅਤੇ ਤੇਜ਼ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਾਬਤ ਕੀਤਾ ਕਿ ਅਜ਼ੂਸਪਰਮੀਆ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। MFN2 ਦਾ ਗੰਭੀਰ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਗੰਭੀਰ OXPHOS ਘਾਟ, ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਭਾਰੀ ਖਪਤ, ਅਤੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੁੱਟੇ ਹੋਏ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨੈਟਵਰਕ ਦੇ ਨਾਲ ਟਰਮੀਨਲ ਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ PN ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਚਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਅੱਗੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦਾ ਇਹ ਰੂਪ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਉੱਨਤ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਵੀ ਠੀਕ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
Mfn2 ਨਾਕਆਊਟ PNs ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਮਾਊਸ ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜੋ Cre-ਨਿਰਭਰ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਨੂੰ ਪੀਲੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (YFP) (mtYFP) (20) Cre ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ PNs ਵਿੱਚ Mfn2 ਜੀਨ ਦਾ ਵਿਨਾਸ਼ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨੈੱਟਵਰਕ (ਚਿੱਤਰ S1A) ਦੇ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਵਿਭਾਜਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਬਦਲਾਅ 3 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, PN ਸੈੱਲ ਪਰਤ ਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪਤਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਕੈਲਬਿੰਡਿਨ ਇਮਯੂਨੋਸਟੇਨਿੰਗ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਹੈ, 12 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਤੱਕ ਸ਼ੁਰੂ ਨਹੀਂ ਹੋਇਆ (ਚਿੱਤਰ 1, A ਅਤੇ B)। ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੌਤ ਦੀ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣ ਵਾਲੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮੇਂ ਦੀ ਬੇਮੇਲਤਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਪਾਚਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ। ਅਸੀਂ YFP (YFP+)-ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਾਲੇ PN (ਚਿੱਤਰ 1C) ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ-ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਸੈੱਲ ਸੌਰਟਿੰਗ (FACS)-ਅਧਾਰਤ ਰਣਨੀਤੀ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ਜਿਸਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ CTRL (ਚਿੱਤਰ S1B) ਕਿਹਾ ਜਾਵੇਗਾ। YFP ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਤੀਬਰਤਾ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਗੇਟਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ ਦਾ ਅਨੁਕੂਲਨ ਸਾਨੂੰ PNs ਦੇ YFP+ ਬਾਡੀ (YFPhigh) ਨੂੰ ਗੈਰ-PNs (YFPneg) (ਚਿੱਤਰ S1B) ਜਾਂ ਪੁਟੇਟਿਵ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਐਕਸੋਨ/ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਟੁਕੜਿਆਂ (YFPlow; ਚਿੱਤਰ S1D, ਖੱਬੇ) ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਚਿੱਤਰ S1D, ਸੱਜੇ) ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਵਰਗੀਕ੍ਰਿਤ ਆਬਾਦੀ ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ LFQ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਅਤੇ ਫਿਰ ਮੁੱਖ ਭਾਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਪਾਇਆ ਕਿ YFPhigh ਅਤੇ YFPneg ਸੈੱਲਾਂ (ਚਿੱਤਰ S1C) ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਪਸ਼ਟ ਵਿਛੋੜਾ ਹੈ। YFPhigh ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ PNs ਮਾਰਕਰਾਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ Calb1, Pcp2, Grid2 ਅਤੇ Itpr3) (21, 22) ਦਾ ਸ਼ੁੱਧ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦਿਖਾਇਆ, ਪਰ ਨਿਊਰੋਨਸ ਜਾਂ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1D) ਵਿੱਚ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਕੋਈ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ। ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਵਰਗੀਕ੍ਰਿਤ YFPhigh ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਤੁਲਨਾ ਨੇ ਇੱਕ ਸਹਿ-ਸਬੰਧ ਗੁਣਾਂਕ> 0.9 ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ (ਚਿੱਤਰ S1E) ਵਿਚਕਾਰ ਚੰਗੀ ਪ੍ਰਜਨਨਯੋਗਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇਹਨਾਂ ਡੇਟਾ ਨੇ ਵਿਵਹਾਰਕ PN ਦੇ ਤੀਬਰ ਅਤੇ ਖਾਸ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗਤਾ ਲਈ ਸਾਡੀ ਯੋਜਨਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ। ਕਿਉਂਕਿ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ L7-cre ਡਰਾਈਵਰ ਸਿਸਟਮ ਡਿਲੀਵਰੀ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪਹਿਲੇ ਹਫ਼ਤੇ ਵਿੱਚ ਮੋਜ਼ੇਕ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ (23), ਅਸੀਂ CTRL ਤੋਂ ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਕੱਟਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ਰਤੀਆ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ਨਿਊਰੋਨਸ ਇਕੱਠੇ ਕਰੋ। ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਪੂਰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ 4 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਿੱਚ Mfn2cKO ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਅੰਤਮ ਬਿੰਦੂ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਚੁਣੀ ਜਦੋਂ ਸਪੱਸ਼ਟ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 1B ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S1A) ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ PN ਪਰਤ ਬਰਕਰਾਰ ਸੀ। ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਅਸੀਂ ਕੁੱਲ 3013 ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲਗਭਗ 22% ਮਾਈਟੋਕਾਰਟਾ 2.0 ਐਨੋਟੇਸ਼ਨਾਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਸਨ ਜੋ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ (ਚਿੱਤਰ 1E) (ਚਿੱਤਰ 1E) (24) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਨ। ਹਫ਼ਤੇ 8 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਵਿਭਿੰਨ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਿਰਫ 10.5% ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਆਏ (ਚਿੱਤਰ 1F ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S1F), ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ 195 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਾਊਨ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਸਨ ਅਤੇ 120 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅੱਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 1F)। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦਾ "ਨਵੀਨਤਾਕਾਰੀ ਮਾਰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ" ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਵਿਭਿੰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਜੀਨ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖਾਸ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਮਾਰਗਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1G) ਦੇ ਇੱਕ ਸੀਮਤ ਸਮੂਹ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹਨ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਹਾਲਾਂਕਿ OXPHOS ਅਤੇ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਸਿਗਨਲਿੰਗ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਮਾਰਗਾਂ ਦਾ ਡਾਊਨਰੇਗੂਲੇਸ਼ਨ ਫਿਊਜ਼ਨ-ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਡਿਸਫੰਕਸ਼ਨ ਦੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਹੋਰ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਜੋ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਉੱਚਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ PNs ਵਿੱਚ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ। ਰੀਵਾਇਰਿੰਗ ਇਕਸਾਰ ਡਿਸਫੰਕਸ਼ਨ ਹੈ।
(A) CTRL ਅਤੇ Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਕਨਫੋਕਲ ਤਸਵੀਰਾਂ ਜੋ PNs (ਕੈਲਬਿੰਡਰ, ਸਲੇਟੀ) ਦੇ ਪ੍ਰਗਤੀਸ਼ੀਲ ਨੁਕਸਾਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ; ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ DAPI ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। (B) (A) ਦੀ ਮਾਤਰਾ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ***P<0.001; n = ਤਿੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ 4 ਤੋਂ 6 ਚੱਕਰ)। (C) ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਵਰਕਫਲੋ। (D) ਪੁਰਕਿੰਜੇ (ਉੱਪਰ) ਅਤੇ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ (ਮੱਧ) ਲਈ ਖਾਸ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦਾ ਹੀਟ ਮੈਪ ਵੰਡ। (E) ਵਰਗੀਕ੍ਰਿਤ PN ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਵੇਨ ਚਿੱਤਰ। (F) 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਜਵਾਲਾਮੁਖੀ ਪਲਾਟ (1.3 ਦਾ ਮਹੱਤਵ ਕੱਟ-ਆਫ ਮੁੱਲ)। (G) ਰਚਨਾਤਮਕਤਾ ਮਾਰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ Mfn2cKO PN ਵਿੱਚ ਪੰਜ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ (ਲਾਲ) ਅਤੇ ਡਾਊਨ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ (ਨੀਲਾ) ਮਾਰਗ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਹਰੇਕ ਖੋਜੇ ਗਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਔਸਤ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਪੱਧਰ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਗ੍ਰੇਸਕੇਲ ਹੀਟ ਮੈਪ: ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ P ਮੁੱਲ। ns, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ।
ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਕੰਪਲੈਕਸ I, III, ਅਤੇ IV ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਘਟਦੀ ਗਈ। ਕੰਪਲੈਕਸ I, III, ਅਤੇ IV ਸਾਰਿਆਂ ਵਿੱਚ ਜ਼ਰੂਰੀ mtDNA-ਏਨਕੋਡਡ ਸਬਯੂਨਿਟਸ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਕੰਪਲੈਕਸ II, ਜੋ ਕਿ ਸਿਰਫ ਨਿਊਕਲੀਅਰ-ਕੋਡਡ ਸੀ, ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2A ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S2A)। . ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟਿਸ਼ੂ ਭਾਗਾਂ ਦੀ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ PN ਵਿੱਚ ਕੰਪਲੈਕਸ IV ਦਾ MTCO1 (ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਸਾਇਟੋਕ੍ਰੋਮ C ਆਕਸੀਡੇਸ ਸਬਯੂਨਿਟ 1) ਸਬਯੂਨਿਟ ਪੱਧਰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਘਟਿਆ (ਚਿੱਤਰ 2B)। mtDNA-ਏਨਕੋਡਡ ਸਬਯੂਨਿਟ Mtatp8 ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ S2A), ਜਦੋਂ ਕਿ ਨਿਊਕਲੀਅਰ-ਏਨਕੋਡਡ ATP ਸਿੰਥੇਸ ਸਬਯੂਨਿਟ ਦਾ ਸਥਿਰ-ਅਵਸਥਾ ਪੱਧਰ ਬਦਲਿਆ ਨਹੀਂ ਰਿਹਾ, ਜੋ ਕਿ mtDNA ਸਮੀਕਰਨ ਸਥਿਰ ਹੋਣ 'ਤੇ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਸਥਿਰ ATP ਸਿੰਥੇਸ ਸਬਅਸੈਂਬਲੀ F1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ। ਗਠਨ ਇਕਸਾਰ ਹੈ। ਰੁਕਾਵਟ (7)। ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (qPCR) ਦੁਆਰਾ ਕ੍ਰਮਬੱਧ Mfn2cKO PNs ਵਿੱਚ mtDNA ਪੱਧਰ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਨੇ mtDNA ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਵਿੱਚ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਕਮੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ। ਕੰਟਰੋਲ ਗਰੁੱਪ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਿੱਚ, mtDNA ਪੱਧਰ ਦਾ ਸਿਰਫ 20% ਹੀ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 2C)। ਇਹਨਾਂ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, Mfn2cKO PNs ਦੇ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਸਟੈਨਿੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ DNA ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ (ਚਿੱਤਰ 2D) ਦੀ ਸਮੇਂ-ਨਿਰਭਰ ਖਪਤ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੁਝ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ ਨੂੰ ਹੀ ਅਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ Lonp1, Afg3l2 ਅਤੇ Clpx, ਅਤੇ OXPHOS ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਅਸੈਂਬਲੀ ਕਾਰਕ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਐਪੋਪਟੋਸਿਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਲੱਭੇ ਗਏ (ਚਿੱਤਰ S2B)। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਅਤੇ ਐਂਡੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਟੀਕੁਲਮ ਚੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਮਾਮੂਲੀ ਬਦਲਾਅ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S2C)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਆਟੋਫੈਜੀ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਮਿਲੇ, ਜੋ ਕਿ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (ਚਿੱਤਰ S3) ਦੁਆਰਾ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ ਦੇ ਦ੍ਰਿਸ਼ਟੀਗਤ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, PNs ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਤੀਸ਼ੀਲ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਸਪੱਸ਼ਟ ਅਲਟਰਾਸਟ੍ਰਕਚਰਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਹੈ। 5 ਅਤੇ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਦੇ Mfn2cKO PNs ਦੇ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀਜ਼ ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਟ੍ਰੀਜ਼ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਕਲੱਸਟਰ ਦੇਖੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਡੂੰਘੇ ਬਦਲਾਅ ਆਏ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S4, A ਅਤੇ B)। ਇਹਨਾਂ ਅਲਟਰਾਸਟ੍ਰਕਚਰਲ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਅਤੇ mtDNA ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ, ਟੈਟਰਾਮੇਥਾਈਲਰੋਡਾਮਾਈਨ ਮਿਥਾਈਲ ਐਸਟਰ (TMRM) ਦੇ ਨਾਲ ਤੀਬਰ ਦਿਮਾਗੀ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ Mfn2cKO PNs ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਗਈ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ S4C)।
(ਏ) OXPHOS ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰ ਦਾ ਸਮਾਂ-ਕੋਰਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ 'ਤੇ ਸਿਰਫ਼ P<0.05 ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕਰੋ (ਦੋ-ਪੱਖੀ ANOVA)। ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ: CTRL ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਕੋਈ ਸਮਾਯੋਜਨ ਨਹੀਂ। (ਬੀ) ਖੱਬੇ: ਐਂਟੀ-MTCO1 ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 20 μm) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ। ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਕਬਜ਼ਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਖੇਤਰ ਪੀਲੇ ਰੰਗ ਨਾਲ ਢੱਕਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਸੱਜੇ: MTCO1 ਪੱਧਰਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪੱਖੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; n = ਤਿੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ 7 ਤੋਂ 20 ਸੈੱਲ)। (ਸੀ) ਕ੍ਰਮਬੱਧ PN ਵਿੱਚ mtDNA ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦਾ qPCR ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪੱਖੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; n = 3 ਤੋਂ 7 ਚੂਹਿਆਂ)। (ਡੀ) ਖੱਬੇ: ਐਂਟੀ-DNA ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 20 μm) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ। ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਕਬਜ਼ਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਖੇਤਰ ਪੀਲੇ ਰੰਗ ਨਾਲ ਢੱਕਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਸੱਜੇ: mtDNA ਜਖਮਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪੱਖੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; n = ਤਿੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ 5 ਤੋਂ 9 ਸੈੱਲ)। (E) ਇੱਕ ਪੂਰੇ-ਸੈੱਲ ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਵਿੱਚ mitoYFP + ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ (ਤੀਰ) ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ ਤੀਬਰ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ। (F) IV ਕਰਵ ਦੀ ਮਾਤਰਾ। (G) CTRL ਅਤੇ Mfn2cKO ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਡੀਪੋਲਰਾਈਜ਼ਿੰਗ ਕਰੰਟ ਇੰਜੈਕਸ਼ਨ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ। ਸਿਖਰਲਾ ਟਰੇਸ: ਪਹਿਲਾ ਪਲਸ ਜਿਸਨੇ AP ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕੀਤਾ। ਹੇਠਲਾ ਟਰੇਸ: ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ। (H) ਪੋਸਟਸਿਨੈਪਟਿਕ ਸਪੋਟੈਨੇਟਿਵ ਇਨਪੁਟਸ (sPSPs) ਦੀ ਮਾਤਰਾ। ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਟਰੇਸ ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਜ਼ੂਮ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ (I) ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਤਿੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ n = 5 ਤੋਂ 20 ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ±SEM ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) ਪਰਫੋਰੇਟਿਡ ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਮੋਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਵੈਚਲਿਤ AP ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਟਰੇਸ। ਸਿਖਰਲਾ ਟਰੇਸ: ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ। ਹੇਠਲਾ ਟਰੇਸ: ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ AP ਦਾ ਜ਼ੂਮ। (K) (J) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਔਸਤ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ। ਮਾਨ-ਵਿਟਨੀ ਟੈਸਟ; n = 5 ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਚਾਰ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ±SEM ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ; ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ।
8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ Mfn2cKO PN ਵਿੱਚ ਸਪੱਸ਼ਟ OXPHOS ਨੁਕਸਾਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ ਸਰੀਰਕ ਕਾਰਜ ਗੰਭੀਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਸਧਾਰਨ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ 4 ਤੋਂ 5 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਅਤੇ 7 ਤੋਂ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ ਤੀਬਰ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਪੂਰੇ-ਸੈੱਲ ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ਕਰਕੇ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀਆਂ ਪੈਸਿਵ ਇਲੈਕਟ੍ਰੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 2E)। ਅਚਾਨਕ, Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਔਸਤ ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਅਤੇ ਇਨਪੁਟ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸੂਖਮ ਅੰਤਰ ਸਨ (ਸਾਰਣੀ 1)। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, 4 ਤੋਂ 5 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਿੱਚ, ਮੌਜੂਦਾ-ਵੋਲਟੇਜ ਸਬੰਧ (IV ਕਰਵ) ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਮਿਲੇ (ਚਿੱਤਰ 2F)। ਹਾਲਾਂਕਿ, 7 ਤੋਂ 8 ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਕੋਈ ਵੀ Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ IV ਰੈਜੀਮੈਨ (ਹਾਈਪਰਪੋਲਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸਟੈਪ) ਤੋਂ ਬਚਿਆ ਨਹੀਂ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਦੇਰ ਦੇ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਹਾਈਪਰਪੋਲਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸੰਭਾਵੀ ਪ੍ਰਤੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਹੈ। ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ, ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਐਕਸ਼ਨ ਪੋਟੈਂਸ਼ੀਅਲ (AP) ਡਿਸਚਾਰਜ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਨ ਵਾਲੇ ਡੀਪੋਲਰਾਈਜ਼ਿੰਗ ਕਰੰਟ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਰਦਾਸ਼ਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਮੁੱਚੇ ਡਿਸਚਾਰਜ ਪੈਟਰਨ 8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ (ਸਾਰਣੀ 1 ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 2G) ਤੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਵੱਖਰੇ ਨਹੀਂ ਹਨ। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਪੋਸਟਸੈਨੈਪਟਿਕ ਕਰੰਟ (sPSCs) ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਐਪਲੀਟਿਊਡ ਕੰਟਰੋਲ ਸਮੂਹ ਦੇ ਲੋਕਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਤੁਲਨਾਯੋਗ ਸਨ, ਅਤੇ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 4 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਤੋਂ 5 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਤੋਂ 7 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਤੋਂ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਤੱਕ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਵਾਧੇ ਨਾਲ ਵਧੀ (ਚਿੱਤਰ 2, H ਅਤੇ I)। PNs ਵਿੱਚ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੀ ਮਿਆਦ (25)। ਛੇਦ ਕੀਤੇ PNs ਪੈਚਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਮਾਨ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਇਹ ਸੰਰਚਨਾ ਸੈਲੂਲਰ ATP ਨੁਕਸਾਂ ਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਮੁਆਵਜ਼ੇ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੂਰੇ-ਸੈੱਲ ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਵਿੱਚ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਅਤੇ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਫਾਇਰਿੰਗ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਈ (ਚਿੱਤਰ 2, J ਅਤੇ K)। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਸਪੱਸ਼ਟ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਵਾਲੇ PN ਉੱਚ-ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਡਿਸਚਾਰਜ ਪੈਟਰਨਾਂ ਦਾ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਇੱਕ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਲਗਭਗ-ਆਮ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।
ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± SEM (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਹੋਲਮ-ਸਿਡਾਕ ਦਾ ਮਲਟੀਪਲ ਤੁਲਨਾ ਟੈਸਟ; *P<0.05) ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਯੂਨਿਟ ਨੰਬਰ ਬਰੈਕਟਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਕਲੇ ਹਾਂ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾਸੈਟ (ਚਿੱਤਰ 1G) ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਉਹ ਰਸਤੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ ਜੋ ਗੰਭੀਰ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਦਾ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇਹ ਸਮਝਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ PN ਲਗਭਗ-ਆਮ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀ ਨੂੰ ਕਿਉਂ ਬਣਾਈ ਰੱਖ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2, E ਤੋਂ K)। ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਬ੍ਰਾਂਚਡ ਚੇਨ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ (BCAA) ਦੇ ਕੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਕਾਫ਼ੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਅੱਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 3A ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5A), ਅਤੇ ਅੰਤਮ ਉਤਪਾਦ ਐਸੀਟਿਲ-CoA (CoA) ਜਾਂ succinyl CoA ਆਰਟੀਰੀਓਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਐਸਿਡ (TCA) ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਈਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਟਸ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ BCAA ਟ੍ਰਾਂਸਾਮਿਨੇਜ 1 (BCAT1) ਅਤੇ BCAT2 ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਵਧੀ ਹੈ। ਉਹ α-ketoglutarate (26) ਤੋਂ ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਪੈਦਾ ਕਰਕੇ BCAA ਕੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਬ੍ਰਾਂਚਡ ਚੇਨ ਕੇਟੋ ਐਸਿਡ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਸ (BCKD) ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਾਰੇ ਸਬਯੂਨਿਟ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ (ਇਹ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ BCAA ਕਾਰਬਨ ਸਕੈਲਟਨ ਦੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਅਤੇ ਅਟੱਲ ਡੀਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕਰਦਾ ਹੈ) (ਚਿੱਤਰ 3A ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5A)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕ੍ਰਮਬੱਧ PN ਵਿੱਚ BCAA ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਪਾਇਆ ਗਿਆ, ਜੋ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਜ਼ਰੂਰੀ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਦੇ ਵਧੇ ਹੋਏ ਸੈਲੂਲਰ ਗ੍ਰਹਿਣ ਜਾਂ TCA ਚੱਕਰ (ਚਿੱਤਰ S5B) ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਸਰੋਤਾਂ (ਗਲੂਕੋਜ਼ ਜਾਂ ਲੈਕਟਿਕ ਐਸਿਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਨੇ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਦੀ ਉਮਰ ਵਿੱਚ ਵਧੀ ਹੋਈ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ ਸੜਨ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੀਨੇਸ਼ਨ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਵੀ ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਲੂਟਾਮਿਨੇਸ (GLS) ਅਤੇ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਟ੍ਰਾਂਸਮੀਨੇਸ 2 (GPT2) (ਚਿੱਤਰ 3, A ਅਤੇ C) ਦੇ ਅਪ-ਨਿਯਮ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਤੀਬਿੰਬਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ GLS ਦਾ ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਸਪਲਾਈਸਡ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਗਲੂਟਾਮਿਨੇਜ C (GLS-GAC) ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ (Mfn2cKO/CTRL ਦਾ ਬਦਲਾਅ ਲਗਭਗ 4.5-ਗੁਣਾ ਹੈ, P = 0.05), ਅਤੇ ਕੈਂਸਰ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਇਸਦਾ ਖਾਸ ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਬਾਇਓਐਨਰਜੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। (27)।
(ਏ) ਹੀਟ ਮੈਪ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਿਰਧਾਰਤ ਰੂਟ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (ਬੀ) ਐਂਟੀ-ਪੀਸੀਐਕਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 20 μm) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਉਦਾਹਰਣ। ਪੀਲਾ ਤੀਰ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀ ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। (ਸੀ) ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਲਈ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਉਮੀਦਵਾਰ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਟਾਈਮ ਕੋਰਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਮਲਟੀਪਲ ਟੀ-ਟੈਸਟ, *FDR <5%; n = 3-5 ਚੂਹੇ)। (ਡੀ) ਉੱਪਰ: [1-13C]ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਟ੍ਰੇਸਰ (ਭਾਵ, PDH ਜਾਂ ਟ੍ਰਾਂਸ-ਆਰਟੀਰੀਅਲ ਰੂਟ ਰਾਹੀਂ) ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਕਾਰਬਨ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। ਹੇਠਾਂ: ਵਾਇਲਨ ਚਾਰਟ [1-13C]ਪਾਈਰੂਵੇਟ (ਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ; ** ਪੀ <0.01) ਨਾਲ ਤੀਬਰ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ, ਸਿਟਰਿਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਮਲਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਬਦਲੇ ਗਏ ਸਿੰਗਲ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਕਾਰਬਨ (M1) ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (ਈ) ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਮਾਰਗ ਦਾ ਵਿਆਪਕ ਸਮਾਂ ਇਤਿਹਾਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ P<0.05 ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕਰੋ। ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ: ਕੋਈ ਸਮਾਯੋਜਨ ਮੁੱਲ ਨਹੀਂ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਦੋ-ਪੱਖੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; * P <0.05; *** P <0.001)। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ±SEM ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਸਾਡੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ, BCAA ਕੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਮੁੱਖ ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਬਣ ਗਿਆ ਹੈ। ਇਹ ਤੱਥ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ TCA ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਵਾਲੀ ਹਵਾਦਾਰੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PN ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਰੀਵਾਇਰਿੰਗ ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਰੂਪ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਗੰਭੀਰ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਰੱਖ-ਰਖਾਅ ਦੌਰਾਨ ਨਿਊਰੋਨਲ ਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀ ਅਤੇ ਬਚਾਅ 'ਤੇ ਸਿੱਧਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਮੁੱਖ ਐਂਟੀ-ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਟਿਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ PCx ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਟਡ ਹੈ (Mfn2cKO/CTRL ਲਗਭਗ 1.5 ਵਾਰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ; ਚਿੱਤਰ 3A), ਜੋ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਦੇ ਆਕਸਲੋਏਸੀਟੇਟ (28) ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (29, 30)। ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧੇ ਸਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ PCx ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਬਰਗਮੈਨ ਗਲਿਆਲ ਸੈੱਲਾਂ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3B)। PCx ਦੇ ਦੇਖੇ ਗਏ ਅੱਪਰੇਗੂਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲਤਾ ਨਾਲ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ [1-13C] ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਟ੍ਰੇਸਰ ਨਾਲ ਤੀਬਰ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ। ਜਦੋਂ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਨੂੰ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਜ (PDH) ਦੁਆਰਾ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਆਈਸੋਟੋਪ ਲੇਬਲ ਗਾਇਬ ਹੋ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ ਜਦੋਂ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਨੂੰ ਨਾੜੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਇਸਨੂੰ TCA ਚੱਕਰ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3D)। ਸਾਡੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਦੇ ਸਮਰਥਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ Mfn2cKO ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਇਸ ਟਰੇਸਰ ਤੋਂ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਮਾਰਕਰਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਿਟਰਿਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਮਲਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਵੀ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਰੁਝਾਨ ਸੀ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3D)।
ਮਾਈਟੋਪਾਰਕ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਡੋਪਾਮਾਈਨ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਡਿਸਫੰਕਸ਼ਨ ਵਾਲੇ ਡੋਪਾਮਾਈਨ ਨਿਊਰੋਨਸ ਜੋ ਕਿ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਫੈਕਟਰ ਏ ਜੀਨ (Tfam) (ਚਿੱਤਰ S6B) ਨੂੰ ਨਸ਼ਟ ਕਰਦੇ ਹਨ, PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਵੀ ਕਾਫ਼ੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਅੱਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (31), ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਸੀਟੋਨ ਐਸਿਡ ਆਰਟੀਰੀਓਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਬਿਮਾਰੀ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਨੂੰ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ OXPHOS ਦੇ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੌਰਾਨ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਵਿਲੱਖਣ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (32-34) ਜੋ ਕਿ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ ਜੋ ਆਰਟੀਰੀਓਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, OXPHOS ਵਿੱਚ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਅੱਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪ੍ਰੋਪੀਓਨਾਇਲ-CoA ਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਜ਼ (PCC-A), ਮੈਲੋਨਾਇਲ-CoA ਨੂੰ ਸੁਕਸੀਨਾਇਲ-CoA ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਮਲਿਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ 3 (ME3) ਵਿੱਚ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੀ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ ਮੈਲੇਟ ਤੋਂ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਨੂੰ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3, A ਅਤੇ C) (33, 35)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਾਨੂੰ Pdk3 ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਮਿਲਿਆ, ਜੋ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ PDH ਨੂੰ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰਦਾ ਹੈ (36), ਜਦੋਂ ਕਿ Pdp1 ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਜੋ PDH ਜਾਂ PDH ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3A)। ਲਗਾਤਾਰ, Mern2cKO PNs ਵਿੱਚ, Ser293 (PDH ਦੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਵਿੱਚ PDH ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਸ E1 ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਦੇ α1 ਸਬਯੂਨਿਟ α (PDHE1α) ਸਬਯੂਨਿਟ ਦੇ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ S6C) (ਚਿੱਤਰ S6C)। ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਦੀ ਕੋਈ ਨਾੜੀ ਪਹੁੰਚ ਨਹੀਂ ਹੈ।
ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ, ਸੀਰੀਨ ਅਤੇ ਗਲਾਈਸੀਨ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ ਦਾ ਸੁਪਰ ਮਾਰਗ, ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫੋਲੇਟ (1C) ਚੱਕਰ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ (ਚਿੱਤਰ 1G ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5C) ਸਾਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੱਪ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਹਨ। ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਡਿਸਫੰਕਸ਼ਨ (5-7) ਨਾਲ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕਨਫੋਕਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ OXPHOS ਗੁੰਮ ਹੋਣ ਵਾਲੇ PN ਵਿੱਚ, 8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਸੀਰੀਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਮਿਥਾਈਲਟ੍ਰਾਂਸਫੇਰੇਜ਼ 2 (SHMT2) ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫੋਲੇਟ ਚੱਕਰ ਦਾ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਹੈ। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਇਮਿਊਨ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (ਚਿੱਤਰ S5D)। 13 CU-ਗਲੂਕੋਜ਼-ਇਨਕਿਊਬੇਟਿਡ ਐਕਿਊਟ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਟਰੇਸਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੇ ਸੀਰੀਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ ਦੇ ਅੱਪ-ਨਿਯਮ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕਾਰਬਨ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਦਾ ਸੀਰੀਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਵਾਹ ਵਧਿਆ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S5E)। ਕਿਉਂਕਿ GLS ਅਤੇ GPT2 ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ ਤੋਂ ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਅਤੇ ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਅਤੇ α-ਕੇਟੋਗਲੂਟਰੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਮੀਨੇਸ਼ਨ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹਨ, ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਉੱਪਰ ਨਿਯਮ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਦੀ ਮੰਗ ਵੱਧ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਇਸਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਪ੍ਰੋਲਾਈਨ ਦੇ ਵਧੇ ਹੋਏ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S5C)। ਇਹਨਾਂ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੇ ਉਲਟ, PN-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਦੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਇਹ ਮਾਰਗ (ਸਾਰੇ ਐਂਟੀਪਰੌਕਸੀਡੇਸ ਸਮੇਤ) ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਬਦਲੇ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਰੀਡਾਇਰੈਕਸ਼ਨ ਡੀਗ੍ਰੇਡਡ PN (ਚਿੱਤਰ S6, D ਤੋਂ G) ਲਈ ਚੋਣਵਾਂ ਹੈ।
ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇਹਨਾਂ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਨੇ PNs ਵਿੱਚ ਖਾਸ ਪਾਚਕ ਮਾਰਗਾਂ ਦੇ ਅਸਥਾਈ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੈਟਰਨਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਅਸਧਾਰਨ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਅਤੇ 1C ਰੀਮਾਡਲਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ 3E ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5C) ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ I ਅਤੇ IV ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਅਨੁਮਾਨਤ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਵੀ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਸੀਰੀਨ ਡੀ ਨੋਵੋ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਸਿਰਫ ਦੇਰ ਨਾਲ ਹੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੋਈਆਂ। OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ (ਚਿੱਤਰ 3E ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S5C)। ਇਹ ਖੋਜਾਂ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਤਣਾਅ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ (1C ਚੱਕਰ) ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ (ਸੀਰੀਨ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ) ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਮੁੜ ਆਕਾਰ ਦੇਣ ਲਈ TCA ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਵਿੱਚ ਵਾਧੇ ਦੇ ਨਾਲ ਸਹਿਜਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਨ।
8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਉੱਚ-ਆਵਿਰਤੀ ਉਤੇਜਨਾ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੀ ਭਰਪਾਈ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪੁਨਰ-ਕਨੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਗੁਜ਼ਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਖੋਜ ਇੱਕ ਦਿਲਚਸਪ ਸੰਭਾਵਨਾ ਪੈਦਾ ਕਰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਸਮੇਂ ਵੀ, ਇਹ ਸੈੱਲ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਦੇਰੀ ਕਰਨ ਜਾਂ ਰੋਕਣ ਲਈ ਇਲਾਜ ਸੰਬੰਧੀ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਵੀ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਦੇਰ ਨਾਲ। ਅਸੀਂ ਦੋ ਸੁਤੰਤਰ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਰਾਹੀਂ ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕੀਤਾ। ਪਹਿਲੀ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ Cre-ਨਿਰਭਰ ਐਡੀਨੋ-ਸਬੰਧਤ ਵਾਇਰਸ (AAV) ਵੈਕਟਰ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਤਾਂ ਜੋ MFN2 ਨੂੰ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਇਨ ਵਿਵੋ (ਚਿੱਤਰ S7A) ਵਿੱਚ ਚੋਣਵੇਂ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। AAV ਏਨਕੋਡਿੰਗ MFN2 ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰਿਪੋਰਟਰ ਜੀਨ mCherry (Mfn2-AAV) ਨੂੰ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਨਿਊਰੋਨ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਕਾਰਨ MFN2 ਨੂੰ Cre-ਨਿਰਭਰ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਨੂੰ ਬਚਾਇਆ ਗਿਆ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ Mfn2cKO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਮਿਊਟੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ (ਚਿੱਤਰ S7, B, D ਅਤੇ E)। ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ 8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ Mfn2-AAV ਨੂੰ Mfn2cKO ਅਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਕਾਰਟੈਕਸ ਤੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਾਉਣ ਲਈ ਇਨ ਵਿਵੋ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ, ਅਤੇ 12-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਚੂਹਿਆਂ (ਚਿੱਤਰ 4A) ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ। ਇਲਾਜ ਕੀਤੇ ਗਏ Mfn2cKO ਚੂਹੇ ਮਰ ਗਏ (ਚਿੱਤਰ 1, A ਅਤੇ B) (16)। ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਕੁਝ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ PN ਦੀ ਚੋਣਵੀਂ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਚਿੱਤਰ S7, G ਅਤੇ H) ਆਈ। ਸਿਰਫ਼ mCherry (Ctrl-AAV) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਕੰਟਰੋਲ AAV ਦੇ ਟੀਕੇ ਦਾ Mfn2cKO ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦੀ ਡਿਗਰੀ 'ਤੇ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਪਿਆ। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, Mfn2-AAV ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੇ ਗਏ Mfn2cKOs ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ PN ਸੈੱਲ ਪਰਤ (ਚਿੱਤਰ 4, B ਅਤੇ C) ਦਾ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੁਰੱਖਿਆ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਿਖਾਇਆ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਨਿਊਰੋਨ ਘਣਤਾ ਕੰਟਰੋਲ ਜਾਨਵਰਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4, B ਅਤੇ C, ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S7, H ਅਤੇ I) ਤੋਂ ਲਗਭਗ ਵੱਖਰਾ ਜਾਪਦਾ ਹੈ। MFN1 ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ ਪਰ MFN2 ਨਹੀਂ, ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਵਿੱਚ ਬਰਾਬਰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 4C ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S7, C ਅਤੇ F), ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਕਟੋਪਿਕ MFN1 ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ MFN2 ਦੀ ਘਾਟ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪੂਰਾ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਸਿੰਗਲ PN ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਹੋਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ Mfn2-AAV ਨੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੇ ਅਲਟਰਾਸਟ੍ਰਕਚਰ ਨੂੰ ਬਚਾਇਆ, mtDNA ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾਇਆ, ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਐਂਜੀਓਜੇਨੇਸਿਸ ਮਾਰਕਰ PCx (ਚਿੱਤਰ 4, C ਤੋਂ E) ਦੇ ਉੱਚ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਦਿੱਤਾ। ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਬਚਾਏ ਗਏ Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਨਿਰੀਖਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਆਸਣ ਅਤੇ ਮੋਟਰ ਲੱਛਣਾਂ (ਗਤੀ S1 ਤੋਂ S3 ਤੱਕ) ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਹੋਇਆ ਸੀ। ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ OXPHOS ਵਿੱਚ ਗੰਭੀਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ MFN2 ਦਾ ਦੇਰੀ ਨਾਲ ਮੁੜ-ਪੇਸ਼ ਕਰਨਾ mtDNA ਦੀ ਖਪਤ ਨੂੰ ਉਲਟਾਉਣ ਅਤੇ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਐਕਸੋਨ ਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
(A) ਇੱਕ ਸਕੀਮ ਜੋ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਮਾਰਗ ਦੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੋਣ 'ਤੇ AAV ਏਨਕੋਡਿੰਗ MFN2 ਦੇ ਟੀਕੇ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮਾਂ-ਸਾਰਣੀ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। (B) Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੇ ਗਏ 12-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਕਨਫੋਕਲ ਚਿੱਤਰ ਅਤੇ ਐਂਟੀ-ਕੈਲਬਿੰਡਰ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਏ। ਸੱਜੇ: ਐਕਸਨ ਫਾਈਬਰਾਂ ਦੀ ਸਕੇਲਿੰਗ। ਐਕਸਨ ਜ਼ੂਮ ਦਾ ਪੈਮਾਨਾ 450 ਅਤੇ 75 μm ਹੈ। (C) ਖੱਬੇ: AAV ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਲੂਪ (AAV+) ਵਿੱਚ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਘਣਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; n = 3 ਚੂਹੇ)। ਸੱਜੇ: ਹਫ਼ਤੇ 12 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੇ PN ਵਿੱਚ mtDNA ਫੋਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਅਨਪੇਅਰਡ ਟੀ-ਟੈਸਟ; ਤਿੰਨ ਚੂਹਿਆਂ ਤੋਂ n = 6 ਸੈੱਲ)। * P <0.05; ** P <0.01. (D) ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਵਾਇਰਲ ਵੈਕਟਰਾਂ ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੇ ਗਏ Mfn2cKO ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗਾਂ ਦੇ PN ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ। ਗੁਲਾਬੀ ਮਾਸਕ ਡੈਂਡਰਾਈਟਸ ਦੁਆਰਾ ਕਬਜ਼ੇ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਪੀਲਾ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲਾ ਵਰਗ ਸੱਜੇ ਪਾਸੇ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਜ਼ੂਮ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ; n ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 1μm। (E) 12 ਹਫ਼ਤਿਆਂ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੇ ਗਏ PN ਵਿੱਚ PCx ਸਟੇਨਿੰਗ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 20μm। OE, ਓਵਰਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ; FC, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ।
ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦਾ ਅਨੁਭਵ ਕਰਨ ਵਾਲੇ PNs ਵਿੱਚ ਪੇਰੋਕਸੀਡੇਸ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਸੈੱਲ ਬਚਾਅ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਊਸ PCx mRNA (AAV-shPCx) ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹੋਏ mCherry ਏਨਕੋਡਿੰਗ AAV-shRNA (ਛੋਟਾ ਵਾਲਾਂ ਦਾ ਪਿੰਨ RNA) ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਵਾਇਰਸ ਜਾਂ ਇਸਦੇ ਸਕ੍ਰੈਂਬਲਡ ਕੰਟਰੋਲ (AAV-scr) ਨੂੰ Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੇਰੀਬੈਲਮ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ। ਟੀਕਾ ਉਮਰ ਦੇ ਚੌਥੇ ਹਫ਼ਤੇ (ਚਿੱਤਰ 5A) ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਉਸ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ PCx ਨੌਕਡਾਊਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ ਜਦੋਂ PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਵਧਿਆ (ਚਿੱਤਰ 3C) ਅਤੇ PN ਸੈੱਲ ਪਰਤ ਅਜੇ ਵੀ ਬਰਕਰਾਰ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 1A)। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ PCx (ਚਿੱਤਰ S8A) ਨੂੰ ਹੇਠਾਂ ਸੁੱਟਣ ਨਾਲ PN ਮੌਤ ਦਾ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਵੇਗ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸੰਕਰਮਿਤ ਰਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ 5, B ਅਤੇ C) ਤੱਕ ਸੀਮਿਤ ਹੈ। PCx ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੀ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ PCx ਨੌਕਡਾਊਨ ਅਤੇ AAV-ਮੱਧਮ ਆਪਟੀਕਲ ਬਾਇਓਸੈਂਸਰ Grx1-roGFP2 ਦੇ ​​ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਪ੍ਰਗਟ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ PNs ਦੀ ਰੀਡੌਕਸ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ S8, B ਤੋਂ D) ਗਲੂਟਾਥੀਓਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਪੇਪਟਾਇਡ ਰੈਡੌਕਸ ਸੰਭਾਵੀ (38) ਦਾ ਸਾਪੇਖਿਕ ਬਦਲਾਅ। ਫਿਰ, ਅਸੀਂ FLIM ਸਥਿਤੀਆਂ (ਚਿੱਤਰ S8, E ਤੋਂ G) ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਡੌਕਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵੀ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ 7-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ Mfn2cKO ਜਾਂ ਕੰਟਰੋਲ ਲਿਟਰਮੇਟਸ ਦੇ ਤੀਬਰ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਲਾਈਫਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ (FLIM) ਕੀਤੀ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ Mfn2cKO PNs ਦੀ ਆਕਸੀਕਰਨ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਕਿ ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਜਾਂ Mfn2cKO PNs ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੈ ਜੋ ਸਿਰਫ਼ ਸਕ੍ਰੈਂਬਲਡ shRNA (ਚਿੱਤਰ 5, D ਅਤੇ E) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਜਦੋਂ PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਡਾਊਨ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਅਵਸਥਾ ਦਿਖਾਉਣ ਵਾਲੇ Mfn2cKO PNs ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤਤਾ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਧ ਗਈ (ਚਿੱਤਰ 5E), ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ PCx ਅੱਪ-ਨਿਯਮ ਨੇ ਡੀਜਨਰੇਟਿਡ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਰੀਡੌਕਸ ਸਮਰੱਥਾ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ।
(A) ਇੱਕ ਸਕੀਮ ਜੋ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਮਾਰਗ ਦੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੋਣ 'ਤੇ AAV ਏਨਕੋਡਿੰਗ shPCx ਦੇ ਟੀਕੇ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮਾਂ-ਸਾਰਣੀ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। (B) Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ 8-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਕਨਫੋਕਲ ਫੋਟੋਆਂ 4 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਵਿੱਚ ਐਂਟੀ-ਕੈਲਸੀਨਿਊਰਿਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਅਤੇ ਲੇਬਲ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 450μm। (C) AAV-ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸਡ ਲੂਪਸ ਵਿੱਚ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਘਣਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦਾ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ; n = 3 ਤੋਂ 4 ਚੂਹਿਆਂ)। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ±SEM ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ; ***P<0.001। (D) ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ FLIM ਤਸਵੀਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਅਧੀਨ 7-ਹਫ਼ਤੇ ਪੁਰਾਣੇ PN ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਗਲੂਟਾਥੀਓਨ ਰੈਡੌਕਸ ਸੈਂਸਰ Grx1-roGFP2 ਦੇ ​​ਔਸਤ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। LUT (ਲੁੱਕ-ਅੱਪ ਟੇਬਲ) ਅਨੁਪਾਤ: ਬਚਾਅ ਸਮਾਂ ਅੰਤਰਾਲ (ਪਿਕੋਸਕਿੰਟ ਵਿੱਚ)। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 25μm। (E) ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ (D) (n=158 ਤੋਂ 368 ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਅਧੀਨ ਦੋ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ) ਤੋਂ Grx1-roGFP2 ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਵੰਡ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਹਰੇਕ ਹਿਸਟੋਗ੍ਰਾਮ ਦੇ ਉੱਪਰ ਪਾਈ ਚਾਰਟ: ਕਾਫ਼ੀ ਲੰਬੇ (ਲਾਲ, ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ) ਜਾਂ ਛੋਟੇ (ਨੀਲੇ, ਘਟੇ ਹੋਏ) ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਮੁੱਲਾਂ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ CTRL-AAV-scr ਵਿੱਚ ਔਸਤ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਮੁੱਲ ਦੇ 1 SD ਤੋਂ ਵੱਧ ਹਨ। (F) ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਮਾਡਲ ਨਿਊਰੋਨਲ PCx ਦੇ ਉੱਪਰਲੇ ਪੱਧਰ ਦੇ ਸੁਰੱਖਿਆ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਸਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਇੱਥੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ MFN2 ਦਾ ਮੁੜ-ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਗੰਭੀਰ OXPHOS ਘਾਟ, ਗੰਭੀਰ mtDNA ਕਮੀ, ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਹੀ ਅਸਧਾਰਨ ista-ਵਰਗੇ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਵਾਲੇ ਉੱਨਤ PN ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਚਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉੱਨਤ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਨਿਰੰਤਰ ਤਰੱਕੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੇ ਪੜਾਅ ਦੇ ਉਲਟ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਲਚਕਤਾ ਦੀ ਇਸ ਡਿਗਰੀ ਨੂੰ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ (TCA ਚੱਕਰ ਦੀ ਰੀਵਾਇਰਿੰਗ) ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੁਆਰਾ ਹੋਰ ਜ਼ੋਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PN ਵਿੱਚ PCx ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਆ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5F)।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਹਨ ਕਿ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਪ੍ਰਤੀ PNs ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮਾਂ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਵਿਭਿੰਨ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਮਾਰਗ ਰਾਹੀਂ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ TCA ਚੱਕਰ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਵਿੱਚ ਕਨਵਰਜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕਈ ਪੂਰਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਕਿ ਜਦੋਂ ਗੰਭੀਰ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੁਆਰਾ ਚੁਣੌਤੀ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਲਚਕਤਾ ਦਾ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਅਣਜਾਣ ਰੂਪ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਸਾਡੇ ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, ਪੂਰੀ ਰੀਵਾਇਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਜ਼ਰੂਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟਰਮੀਨਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਅਤੇ ਅਟੱਲ ਹੈ, ਪਰ ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਵੀ ਇੱਕ ਰੱਖ-ਰਖਾਅ ਨਿਊਰੋਨ ਦਾ ਗਠਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਵਿਧੀ। ਇਹ ਖੋਜ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਹੱਦ ਤੱਕ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪਲਾਸਟਿਕਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਤੱਥ ਸਾਬਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ MFN2 ਦਾ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਪੁਨਰ-ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਮੁੱਖ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ PN ਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਸਦੇ ਉਲਟ, ਇਹ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਨਸਾਂ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਟ੍ਰਾਂਸਸੈਕਸੁਅਲ।
ਸਾਡੀ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਦਿਲਚਸਪ ਖੋਜਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਇਹ ਹੈ ਕਿ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ PN, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਰਟੀਰੀਓਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਨੂੰ ਅੱਪ-ਰੈਗੂਲੇਟ ਕਰਕੇ TCA ਚੱਕਰ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਨੂੰ ਸੋਧ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪੁਨਰਗਠਨ ਕੈਂਸਰ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਆਮ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ TCA ਚੱਕਰ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟਸ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਮਾਨ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਣ, ਜੋ ਸਾਹ ਦੀ ਲੜੀ ਨੂੰ ਚਲਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਬਾਇਓਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪੂਰਵਗਾਮੀਆਂ ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਦੇ ਹਨ (39, 40)। ਇੱਕ ਤਾਜ਼ਾ ਅਧਿਐਨ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ OXPHOS ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦਾ ਅਨੁਭਵ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪੈਰੀਫਿਰਲ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ, ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ/ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦਾ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਵੀ ਇੱਕ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ (5, 41), ਜਿੱਥੇ TCA ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਗਲੂਟਾਮਾਈਨ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੀ ਦਿਸ਼ਾ OXPHOS ਸੱਟ ਦੀ ਗੰਭੀਰਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ (41)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪਲਾਸਟਿਕਿਟੀ ਦੀ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸਮਾਨਤਾ ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ ਇਸਦੀ ਸੰਭਾਵਿਤ ਸਾਰਥਕਤਾ ਬਾਰੇ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸਬੂਤ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ। ਇੱਕ ਹਾਲ ਹੀ ਦੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਲਈ ਗਲੂਟਾਮਾਈਟ ਪੂਲ ਨੂੰ ਜੁਟਾਉਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਤਣਾਅ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ (42) ਦੇ ਅਧੀਨ ਆਕਸੀਡੇਟਿਵ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਅਤੇ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਟੀਸੀਏ ਸਾਈਕਲ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਸੁਕਸੀਨੇਟ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨੇਜ ਦੇ ਫਾਰਮਾਕੋਲੋਜੀਕਲ ਇਨਿਹਿਬਸ਼ਨ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਕਲਚਰਡ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਗ੍ਰੈਨਿਊਲ ਨਿਊਰੋਨਸ (34) ਵਿੱਚ ਆਕਸਾਲੋਐਸੀਟੇਟ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਲਈ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ (ਜਿੱਥੇ ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਤੱਕ ਸੀਮਤ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਲਈ ਇਹਨਾਂ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਸਰੀਰਕ ਸਾਰਥਕਤਾ ਅਜੇ ਵੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਰੀਰਕ ਮਹੱਤਵ ਰੱਖਦੀ ਹੈ (43)। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ OXPHOS ਦੁਆਰਾ ਨੁਕਸਾਨੇ ਗਏ PNs ਨੂੰ BCAA ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ TCA ਪੂਲ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟਸ ਦੇ ਪੂਰਕ ਦੇ ਦੋ ਮੁੱਖ ਸਰੋਤ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਨਿਊਰੋਨਲ ਊਰਜਾ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਵਿੱਚ BCAA ਕੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਦੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਯੋਗਦਾਨ ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਨਿਊਰੋਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ (44) ਲਈ ਗਲੂਟਾਮੇਟ ਅਤੇ GABA ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਵਿਧੀਆਂ ਲਈ ਅਜੇ ਵੀ ਕੋਈ ਸਬੂਤ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣਾ ਆਸਾਨ ਹੈ ਕਿ ਅਯੋਗ PNs ਐਥੀਰੋਸਕਲੇਰੋਸਿਸ ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ ਐਸੀਮਿਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਚਲਾਏ ਗਏ TCA ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟਸ ਦੀ ਖਪਤ ਲਈ ਆਪਣੇ ਆਪ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਦੇ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਵਧਦੀ ਮੰਗ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਲਈ PCx ਦੇ ਉੱਪਰਲੇ ਪੱਧਰ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਵਾਲੇ ਫੈਲਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (45)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਡੇ ਮੈਟਾਬੋਲੌਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ Mfn2cKO PNs (ਚਿੱਤਰ S6A) ਵਿੱਚ ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ ਦੇ ਸਥਿਰ-ਅਵਸਥਾ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ, ਜੋ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫੈਲਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਪੋਸਟ-ਮਾਈਟੋਟਿਕ ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਐਸਪਾਰਟਿਕ ਐਸਿਡ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਾਚਕ ਉਪਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਡਿਸਫੰਕਸ਼ਨਲ ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਵਿੱਚ PCx ਉੱਪਰਲੇ ਪੱਧਰ ਦੀ ਸਹੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਜੇ ਵੀ ਬਾਕੀ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਦੀ ਰੈਡੌਕਸ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਟੁਕੜਿਆਂ 'ਤੇ FLIM ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, PNs ਨੂੰ PCx ਨੂੰ ਉੱਪਰਲੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਰੱਖਣ ਤੋਂ ਰੋਕਣ ਨਾਲ ਇੱਕ ਹੋਰ ਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਅਵਸਥਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਮੌਤ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। BCAA ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਦੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਦਾ ਕਾਰਬੋਕਸੀਲੇਸ਼ਨ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਪੈਰੀਫਿਰਲ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਦੇ ਤਰੀਕੇ ਨਹੀਂ ਹਨ (7)। ਇਸ ਲਈ, ਉਹ OXPHOS-ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਇੱਕ ਤਰਜੀਹੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਜਾਪਦੇ ਹਨ, ਭਾਵੇਂ ਇਹ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨਾ ਹੋਵੇ, ਜੋ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।
ਸੇਰੇਬੇਲਰ ਬਿਮਾਰੀ ਇੱਕ ਵਿਭਿੰਨ ਕਿਸਮ ਦੀ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਟਿਵ ਬਿਮਾਰੀ ਹੈ ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਟੈਕਸੀਆ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਅਕਸਰ PNs ਨੂੰ ਨੁਕਸਾਨ ਪਹੁੰਚਾਉਂਦੀ ਹੈ (46)। ਇਹ ਨਿਊਰੋਨ ਆਬਾਦੀ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਲਈ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦਾ ਚੋਣਵਾਂ ਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਮਨੁੱਖੀ ਸਪਾਈਨੋਸੇਰੇਬੇਲਰ ਅਟੈਕਸੀਆ (16, 47, 48) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮੋਟਰ ਲੱਛਣਾਂ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਹੈ। ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਇੱਕ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਜੀਨ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਜੇਨਿਕ ਮਾਊਸ ਮਾਡਲ ਮਨੁੱਖੀ ਸਪਾਈਨੋਸੇਰੇਬੇਲਰ ਅਟੈਕਸੀਆ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ (49, 50) ਹੈ, ਜੋ PNPH ਵਿੱਚ OXPHOS ਦੀ ਘਾਟ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਇਸ ਵਿਲੱਖਣ ਨਿਊਰੋਨ ਆਬਾਦੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਅਤੇ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇਹ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ PNs ਦਬਾਅ ਪ੍ਰਤੀ ਬਹੁਤ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਸੈੱਲ ਆਬਾਦੀ ਦੇ ਘੱਟ ਅਨੁਪਾਤ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਓਮਿਕਸ-ਅਧਾਰਿਤ ਅਧਿਐਨਾਂ ਲਈ, ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਚੋਣਵਾਂ ਵੱਖ ਕਰਨਾ ਅਜੇ ਵੀ ਇੱਕ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਪਹਿਲੂ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ (ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਬਾਲਗ ਟਿਸ਼ੂਆਂ) ਦੇ ਦੂਸ਼ਣ ਦੀ ਪੂਰੀ ਘਾਟ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਲਗਭਗ ਅਸੰਭਵ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਸੰਖਿਆ ਵਿੱਚ ਵਿਵਹਾਰਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ FACS ਨਾਲ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਵਿਛੋੜਾ ਕਦਮ ਜੋੜਿਆ, ਅਤੇ ਪੂਰੇ ਸੇਰੀਬੈਲਮ (51) ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਕਾਫ਼ੀ ਉੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਵਰੇਜ (ਲਗਭਗ 3000 ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ। ਪੂਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖ ਕੇ, ਅਸੀਂ ਇੱਥੇ ਜੋ ਵਿਧੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਉਹ ਸਾਨੂੰ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਵਿੱਚ ਪਾਚਕ ਮਾਰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਇਸਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਹਮਰੁਤਬਾ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਵੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਝਿੱਲੀ ਟੈਗਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਲਈ ਨਵਾਂ ਤਰੀਕਾ (52, 53)। ਅਸੀਂ ਜਿਸ ਵਿਧੀ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਉਹ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅਧਿਐਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਬਿਮਾਰ ਦਿਮਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਚਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿਸੇ ਵੀ ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੈੱਲ 'ਤੇ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੇ ਹੋਰ ਮਾਡਲ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।
ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪੁਨਰਗਠਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਇਲਾਜ ਵਿੰਡੋ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ ਜੋ ਸੈਲੂਲਰ ਤਣਾਅ ਦੇ ਮੁੱਖ ਸੰਕੇਤਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉਲਟਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਨਲ ਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਇੱਥੇ ਦੱਸੇ ਗਏ ਰੀਵਾਇਰਿੰਗ ਦੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਨਪੁੰਸਕਤਾ ਦੌਰਾਨ ਨਿਊਰੋਨਲ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਣ ਲਈ ਸੰਭਾਵਿਤ ਇਲਾਜਾਂ ਵਿੱਚ ਬੁਨਿਆਦੀ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਹੋਰ ਦਿਮਾਗੀ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਊਰਜਾ ਮੈਟਾਬੋਲਿਜ਼ਮ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਦੇ ਉਦੇਸ਼ ਨਾਲ ਭਵਿੱਖ ਦੀ ਖੋਜ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਇਸ ਸਿਧਾਂਤ ਦੀ ਹੋਰ ਨਿਊਰੋਲੌਜੀਕਲ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਲਈ ਲਾਗੂ ਹੋਣ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।
MitoPark ਚੂਹਿਆਂ ਦਾ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (31)। loxP ਫਲੈਂਕਿੰਗ Mfn2 ਜੀਨਾਂ ਵਾਲੇ C57BL/6N ਚੂਹਿਆਂ ਦਾ ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (18) ਅਤੇ L7-Cre ਚੂਹਿਆਂ (23) ਨਾਲ ਪਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਦੋਹਰੇ ਹੇਟਰੋਜ਼ਾਈਗਸ ਪ੍ਰਜਨੀ ਨੂੰ ਫਿਰ ਹੋਮੋਜ਼ਾਈਗਸ Mfn2loxP/Mfn2loxP ਚੂਹਿਆਂ ਨਾਲ ਪਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਤਾਂ ਜੋ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ਲਈ ਪੁਰਕਿਨਜੇ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਜੀਨ ਨਾਕਆਊਟ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਣ। ਮੇਲਣ ਦੇ ਇੱਕ ਸਬਸੈੱਟ ਵਿੱਚ, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ਐਲੀਲ (stop-mtYFP) ਨੂੰ ਵਾਧੂ ਕਰਾਸਿੰਗਾਂ (20) ਰਾਹੀਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਰੀਆਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਯੂਰਪੀਅਨ, ਰਾਸ਼ਟਰੀ ਅਤੇ ਸੰਸਥਾਗਤ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ ਅਤੇ ਜਰਮਨੀ ਦੇ ਉੱਤਰੀ ਰਾਈਨ-ਵੈਸਟਫਾਲੀਆ ਦੇ ਉਮਵੇਲਟ ਅਤੇ ਵਰਬ੍ਰਾਉਚਰਚੁਟਜ਼ ਦੇ ਲੈਂਡੇਸਾਮਟਫੁਰਨਾਟੁਰ ਦੁਆਰਾ ਮਨਜ਼ੂਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਦਾ ਕੰਮ ਯੂਰਪੀਅਨ ਫੈਡਰੇਸ਼ਨ ਆਫ ਲੈਬਾਰਟਰੀ ਐਨੀਮਲ ਸਾਇੰਸਜ਼ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਮਾਰਗਦਰਸ਼ਨ ਦੀ ਵੀ ਪਾਲਣਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਗਰਭਵਤੀ ਔਰਤ ਦੇ ਸਰਵਾਈਕਲ ਡਿਸਲੋਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਬੇਹੋਸ਼ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਚੂਹੇ ਦੇ ਭਰੂਣ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (E13)। ਕਾਰਟੈਕਸ ਨੂੰ ਹੈਂਕਸ ਦੇ ਬੈਲੇਂਸਡ ਸਾਲਟ ਸਲਿਊਸ਼ਨ (HBSS) ਵਿੱਚ 10 mM ਹੀਪਸ ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਡੁਲਬੇਕੋ ਦੇ ਮੋਡੀਫਾਈਡ ਈਗਲਜ਼ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਪਾਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪੈਪੇਨ (20 U/ml) ਅਤੇ ਸਿਸਟੀਨ (1μg/ml) ਸੀ। ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ DMEM ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ) ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਪਾਚਨ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕਰੋ। Ml) 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 37°C 'ਤੇ, ਅਤੇ ਫਿਰ 10% ਭਰੂਣ ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤੇ DMEM ਵਿੱਚ ਮਕੈਨੀਕਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ। ਇਮੇਜਿੰਗ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪੋਲੀਲਾਈਸਿਨ ਨਾਲ ਲੇਪ ਕੀਤੇ ਕੱਚ ਦੇ ਕਵਰਲਿਪਸ 'ਤੇ 2×106 ਪ੍ਰਤੀ 6 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਕਲਚਰ ਡਿਸ਼ ਜਾਂ 0.5×105 ਸੈੱਲ/cm2 ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਬੀਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। 4 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ ਸੀਰਮ-ਮੁਕਤ ਮਾਧਿਅਮ ਨਾਲ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1% B27 ਪੂਰਕ ਅਤੇ 0.5 mM ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ ਸੀ। ਫਿਰ ਪੂਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੌਰਾਨ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ 37°C ਅਤੇ 5% CO2 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਹਫ਼ਤੇ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵਾਰ ਖੁਆਇਆ ਗਿਆ। ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਪੁਨਰ-ਸੰਯੋਜਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਦੂਜੇ ਦਿਨ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠ ਦਿੱਤੇ AAV9 ਵਾਇਰਸ ਵੈਕਟਰ ਦੇ 3μl (24-ਵੈੱਲ ਕਲਚਰ ਡਿਸ਼) ਜਾਂ 0.5μl (24-ਵੈੱਲ ਪਲੇਟ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (ਐਡਜੀਨ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 105530-AAV9) ਅਤੇ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ਐਡਜੀਨ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 105545-AAV9)।
ਮਾਊਸ Mfn1 ਅਤੇ Mfn2 ਪੂਰਕ DNA (ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਐਡਜੀਨ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ #23212 ਅਤੇ #23213 ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ) ਨੂੰ C-ਟਰਮੀਨਸ 'ਤੇ V5 ਕ੍ਰਮ (GKPIPNPLLGLDST) ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ T2A ਕ੍ਰਮ ਰਾਹੀਂ ਫਰੇਮ ਵਿੱਚ mCherry ਨਾਲ ਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। Grx1-roGFP2 ਹਾਈਡਲਬਰਗ TP ਡਿੱਕ DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ਤੋਂ ਇੱਕ ਤੋਹਫ਼ਾ ਹੈ। ਰਵਾਇਤੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ tdTomato ਕੈਸੇਟ ਨੂੰ ਬਦਲ ਕੇ, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ਬੈਕਬੋਨ (ਐਡਜੀਨ ਰੈਫਰੈਂਸ ਨੰਬਰ 28306) ਵਿੱਚ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ਅਤੇ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ਵੈਕਟਰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਕੈਸੇਟ ਨੂੰ ਸਬਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੰਟਰੋਲ ਵੈਕਟਰ pAAV-CAG-FLEX-mCherry ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਰਣਨੀਤੀ ਵਰਤੀ ਗਈ ਸੀ। AAV-shPCx ਨਿਰਮਾਣ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਇੱਕ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ AAV ਵੈਕਟਰ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ shRNA ਟਾਰਗੇਟਿੰਗ ਮਾਊਸ PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਨ ਵਾਲਾ DNA ਕ੍ਰਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। U6 ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ, mCherry ਦੀ ਵਰਤੋਂ CMV ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸਹਾਇਕ AAV ਵੈਕਟਰਾਂ ਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀਆਂ ਹਦਾਇਤਾਂ (ਸੈੱਲ ਬਾਇਓਲੈਬਸ) ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ ਜੋ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ਨੂੰ 293AAV ਸੈੱਲਾਂ-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ਜਾਂ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ਕੋਡਿੰਗ ਜੀਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ AAV1 ਕੈਪਸਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਸਹਾਇਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕੋਡਿੰਗ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਪੈਕਿੰਗ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ। ਕੱਚਾ ਵਾਇਰਸ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਸੁੱਕੀ ਬਰਫ਼/ਈਥੇਨੌਲ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਥੌ ਚੱਕਰਾਂ ਅਤੇ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰਡ ਸਲਾਈਨ (PBS) ਵਿੱਚ ਲਾਈਜ਼ਡ ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। AAV ਵੈਕਟਰ ਨੂੰ ਡਿਸਕੰਟੀਨਿਊਸ ਆਇਓਡਿਕਸਨੋਲ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਅਲਟ੍ਰਾਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ (32,000 rpm ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ 24 ਘੰਟੇ) ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ Amicon ultra-15 ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗਲ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ਜੀਨੋਮ ਕਾਪੀ (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ਦਾ ਜੀਨੋਮ ਟਾਈਟਰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੀ (54), ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਕੁਆਂਟਿਟੀਟਿਵ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ਅਤੇ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ 1x PBS ਵਿੱਚ ਸਕ੍ਰੈਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਪੈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ 0.5% ਟ੍ਰਾਈਟਨ X-100 / 0.5% ਸੋਡੀਅਮ ਡੀਓਕਸੀਕੋਲੇਟ/PBS ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਫਾਸਫੇਟੇਸ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰ (ਰੋਚੇ) ਸਨ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਬਾਈਸਿੰਕੋਨੀਨਿਕ ਐਸਿਡ ਅਸੇ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨੂੰ SDS-ਪੋਲੀਆਕ੍ਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇੱਕ ਪੌਲੀਵਿਨਾਇਲਾਈਡੀਨ ਫਲੋਰਾਈਡ ਝਿੱਲੀ (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ) 'ਤੇ ਧੱਬਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ। ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਬਲਾਕ ਕਰੋ ਅਤੇ TBST (ਟਵੀਨ ​​ਦੇ ਨਾਲ ਟ੍ਰਿਸ-ਬਫਰਡ ਖਾਰਾ), ਧੋਣ ਦੇ ਕਦਮਾਂ ਅਤੇ TBST ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਵਿੱਚ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਵਿੱਚ 5% ਦੁੱਧ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਵੇਰਵਿਆਂ ਲਈ ਟੇਬਲ S1 ਵੇਖੋ) ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। +4°C 'ਤੇ ਰਾਤ ਭਰ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਲਗਾਓ। ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਐਂਟੀ-β-ਐਕਟਿਨ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਉਸੇ ਧੱਬੇ ਨੂੰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਕੇ, ਉਸੇ ਲੋਡਿੰਗ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਕੈਮੀਲੂਮਿਨਿਸੈਂਸ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਕੇ ਅਤੇ ਕੈਮੀਲੂਮਿਨਿਸੈਂਸ ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ ਖੋਜ (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ)।
ਕੱਚ ਦੇ ਕਵਰਲਿਪਸ 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਸੀਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਸਮੇਂ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 4% ਪੈਰਾਫਾਰਮਲਡੀਹਾਈਡ (PFA)/PBS ਨਾਲ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਵਰਲਿਪਸ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 0.1% ਟ੍ਰਾਈਟਨ X-100/PBS ਨਾਲ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ [3% ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ ਐਲਬਿਊਮਿਨ (BSA)/PBS] ਵਿੱਚ। ਦੂਜੇ ਦਿਨ, ਕਵਰਲਿਪਸ ਨੂੰ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਫਲੋਰੋਫੋਰ-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ; ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ PBS ਵਿੱਚ 4′,6-ਡਾਇਮੀਡੀਨੋ-2 ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਧੋਤਾ ਗਿਆ -ਫੇਨੀਲਿੰਡੋਲ (DAPI) ਦਾ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਐਕਵਾ-ਪੋਲੀ/ਮਾਊਂਟ ਨਾਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਸਲਾਈਡ 'ਤੇ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਚੂਹਿਆਂ (ਮਰਦ ਅਤੇ ਮਾਦਾ) ਨੂੰ ਕੇਟਾਮਾਈਨ (130 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਅਤੇ ਜ਼ਾਈਲਾਜ਼ੀਨ (10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਦੇ ਇੰਟਰਾਪੇਰੀਟੋਨੀਅਲ ਟੀਕੇ ਦੁਆਰਾ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਾਰਪ੍ਰੋਫੇਨ ਐਨਲਜੈਸਿਕ (5 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਨਾਲ ਚਮੜੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਗਰਮ ਪੈਡ ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਯੰਤਰ (ਕੋਪਫ) ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ। ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹੋ ਅਤੇ ਮਿਸ ਹੱਡੀ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਕਾਰਟੈਕਸ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਦੰਦਾਂ ਦੀ ਮਸ਼ਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਲੈਮਡਾ ਤੋਂ: ਪੂਛ 1.8, ਲੇਟਰਲ 1, ਲੋਬਿਊਲ IV ਅਤੇ V ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ)। ਹੇਠਾਂ ਨਾੜੀਆਂ ਨੂੰ ਵਿਘਨ ਪਾਉਣ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਖੋਪੜੀ ਵਿੱਚ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਜਿਹਾ ਛੇਕ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਕਰਵਡ ਸਰਿੰਜ ਸੂਈ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਫਿਰ ਪਤਲੇ ਖਿੱਚੇ ਹੋਏ ਕੱਚ ਦੇ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਮਾਈਕ੍ਰੋ-ਹੋਲ ਵਿੱਚ ਪਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਡਿਊਰਾ ਮੈਟਰ ਦੇ ਵੈਂਟ੍ਰਲ ਸਾਈਡ 'ਤੇ -1.3 ਤੋਂ -1 ਤੱਕ), ਅਤੇ 200 ਤੋਂ 300 nl AAV ਨੂੰ 10 ਤੋਂ 20 ਮਿੰਟ ਦੀ ਖਿੜਕੀ ਦੇ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਘੱਟ ਦਬਾਅ 'ਤੇ ਕਈ ਵਾਰ ਹੱਥੀਂ ਸਰਿੰਜਾਂ (ਨਾਰੀਸ਼ੀਜ) ਨਾਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋ-ਇੰਜੈਕਟਰ (ਨਾਰੀਸ਼ੀਜ) ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਨਿਵੇਸ਼ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਫੈਲਣ ਦੇਣ ਲਈ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਨੂੰ ਹੋਰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਰੱਖੋ। ਕੇਸ਼ਿਕਾਵਾਂ ਨੂੰ ਵਾਪਸ ਲੈਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਜ਼ਖ਼ਮ ਦੀ ਸੋਜਸ਼ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਜਾਨਵਰ ਨੂੰ ਠੀਕ ਹੋਣ ਦੇਣ ਲਈ ਚਮੜੀ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਸੀਵ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕਈ ਦਿਨਾਂ ਤੱਕ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦਾ ਦਰਦਨਾਸ਼ਕ (ਕੈਸਪੋਫੇਨ) ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਜਿਸ ਸਮੇਂ ਦੌਰਾਨ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਸਰੀਰਕ ਸਥਿਤੀ ਦੀ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਦੱਸੇ ਗਏ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਈਥਨਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਾਰੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਯੂਰਪੀਅਨ, ਰਾਸ਼ਟਰੀ ਅਤੇ ਸੰਸਥਾਗਤ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ ਅਤੇ ਜਰਮਨੀ ਦੇ ਉੱਤਰੀ ਰਾਈਨ-ਵੈਸਟਫਾਲੀਆ ਦੇ ਉਮਵੇਲਟ ਅਤੇ ਵਰਬ੍ਰਾਉਚਰਚੁਟਜ਼ ਦੇ ਲੈਂਡੇਸਮਟਫੁਰਨਾਟੁਰ ਦੁਆਰਾ ਮਨਜ਼ੂਰੀ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਕੇਟਾਮਾਈਨ (100 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਅਤੇ ਜ਼ਾਈਲਾਜ਼ੀਨ (10 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ/ਕਿਲੋਗ੍ਰਾਮ) ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਦਿਲ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ 0.1 ਐਮ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 4% ਪੀਐਫਏ ਨਾਲ। ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ ਕੱਟ ਕੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ 4% ਪੀਐਫਏ/ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ 4°C 'ਤੇ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਸੈਜਿਟਲ ਭਾਗ (50 μm ਮੋਟਾ) ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਵਾਈਬ੍ਰੇਟਿੰਗ ਚਾਕੂ (ਲੀਕਾ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ ਜੀਐਮਬੀਐਚ, ਵਿਯੇਨ੍ਨਾ, ਆਸਟਰੀਆ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਹੋਰ ਨਹੀਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ, ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ (13) ਫ੍ਰੀ-ਫਲੋਟਿੰਗ ਭਾਗਾਂ ਦਾ ਸਟੈਨਿੰਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਹਿਲਾਇਆ ਗਿਆ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਪਹਿਲਾਂ, ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 0.5% ਟ੍ਰਾਈਟਨ ਐਕਸ-100/ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਪਾਰਮੇਬਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ; ਕੁਝ ਐਪੀਟੋਪਾਂ (ਪੀਸੀਐਕਸ ਅਤੇ ਸ਼ਮਟ2) ਲਈ, 80°C (PH 9) 'ਤੇ ਟ੍ਰਿਸ-ਈਡੀਟੀਏ ਬਫਰ ਦੁਆਰਾ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇਸ ਕਦਮ ਦੀ ਬਜਾਏ 25 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਗਰਮ ਕਰੋ। ਅੱਗੇ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ (3% BSA/PBS) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਟੇਬਲ S1 ਵੇਖੋ) ਨਾਲ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ ਹਿਲਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਅਗਲੇ ਦਿਨ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਬਲਾਕਿੰਗ ਬਫਰ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਫਲੋਰੋਫੋਰ-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ; ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ PBS ਵਿੱਚ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, DAPI ਨਾਲ ਕਾਊਂਟਰ-ਸਟੇਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਸਲਾਈਡ 'ਤੇ ਐਕੁਆਪੋਲੀਮਾਊਂਟ ਨਾਲ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਤਸਵੀਰ ਲੈਣ ਲਈ ਇੱਕ ਲੇਜ਼ਰ ਸਕੈਨਿੰਗ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (TCS SP8-X ਜਾਂ TCS ਡਿਜੀਟਲ ਲਾਈਟ ਸ਼ੀਟ, Leica ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਚਿੱਟੇ ਰੌਸ਼ਨੀ ਵਾਲੇ ਲੇਜ਼ਰ ਅਤੇ ਇੱਕ 405 ਡਾਇਓਡ ਅਲਟਰਾਵਾਇਲਟ ਲੇਜ਼ਰ ਨਾਲ ਲੈਸ ਸੀ। ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਡਿਟੈਕਟਰ (HyDs) ਨਾਲ ਸਿਗਨਲ ਇਕੱਠਾ ਕਰਕੇ, LAS-X ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਮੋਡ ਵਿੱਚ Nyquist ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸਟੈਕਡ ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ: ਗੈਰ-ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੈਨਲਾਂ ਲਈ, ਇਹ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਸਿਗਨਲ ਹਨ (ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਸੋਮੈਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਾਈਟਸ ਵਿੱਚ) mtYFP) BrightR ਮੋਡ ਵਿੱਚ PNs ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ HyD ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ)। ਪਿਛੋਕੜ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ 0.3 ਤੋਂ 6 ns ਤੱਕ ਗੇਟਿੰਗ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
ਛਾਂਟੀ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ। 1% B27 ਸਪਲੀਮੈਂਟ ਅਤੇ 0.5 mM ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ-ਏ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਛਾਂਟੀ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਤੁਰੰਤ ਪੌਲੀ-ਐਲ-ਲਾਈਸਿਨ-ਕੋਟੇਡ ਗਲਾਸ ਸਲਾਈਡਾਂ (μ-ਸਲਾਈਡ8 ਵੈੱਲ, ਇਬੀਡੀ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 80826) 'ਤੇ ਸੀਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ 37°C ਅਤੇ 5% CO2 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਰੱਖੋ ਤਾਂ ਜੋ ਸੈੱਲ ਸੈਟਲ ਹੋ ਸਕਣ। ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਇੱਕ ਚਿੱਟੇ ਲੇਜ਼ਰ, HyD, 63×[1.4 ਸੰਖਿਆਤਮਕ ਅਪਰਚਰ (NA)] ਤੇਲ ਉਦੇਸ਼ ਲੈਂਸ ਅਤੇ ਇੱਕ ਹੀਟਿੰਗ ਪੜਾਅ ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ Leica SP8 ਲੇਜ਼ਰ ਸਕੈਨਿੰਗ ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਜਲਦੀ ਹੀ ਕਾਰਬਨ ਡਾਈਆਕਸਾਈਡ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਿਰ ਵੱਢ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਜਲਦੀ ਹੀ ਖੋਪੜੀ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ 200μm ਮੋਟੀ (13C ਲੇਬਲਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ) ਜਾਂ 275μm ਮੋਟੀ (ਦੋ ਫੋਟੋਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ) ਸੈਜਿਟਲ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਕੱਟ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਹੇਠ ਲਿਖੀਆਂ ਸਮੱਗਰੀਆਂ ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਹੋਇਆ। ਆਈਸ ਕਰੀਮ (HM-650 V, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਵਾਲਡੋਰਫ, ਜਰਮਨੀ) ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਪਦਾਰਥਾਂ ਨਾਲ ਭਰੀ ਹੋਈ ਹੈ: 125 mM ਬਰਫ਼-ਠੰਡੀ, ਕਾਰਬਨ-ਸੰਤ੍ਰਪਤ (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2) ਘੱਟ Ca2 + ਨਕਲੀ ਦਿਮਾਗੀ ਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25 mM NaHCO3, 25 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, 0.5 mM CaCl2 ਅਤੇ 3.5 mM MgCl2 (310 ਤੋਂ 330 mmol ਦਾ ਅਸਮੋਟਿਕ ਦਬਾਅ)। ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰੀ-ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਉੱਚ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ਗਲੂਕੋਜ਼, 1.0 mM CaCl2 ਅਤੇ 2.0 mM MgCl2 (ਮੱਧਮ) pH 7.4 ਅਤੇ 310 ਤੋਂ 320 mmol) ਹੋਵੇ।
ਇਮੇਜਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ, ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਮਰਪਿਤ ਇਮੇਜਿੰਗ ਰੂਮ ਵਿੱਚ ਭੇਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗ 32° ਤੋਂ 33°C ਦੇ ਨਿਰੰਤਰ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਨਿਰੰਤਰ ACSF ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇੱਕ ਮਲਟੀਫੋਟੋਨ ਲੇਜ਼ਰ ਸਕੈਨਿੰਗ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ਜੋ Leica 25x ਆਬਜੈਕਟਿਵ ਲੈਂਸ (NA 0.95, ਪਾਣੀ), Ti: Sapphire ਲੇਜ਼ਰ (Cameleon Vision II, Coherent) ਨਾਲ ਲੈਸ ਸੀ, ਸਲਾਈਸ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। FLIM ਮੋਡੀਊਲ (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 ਦਾ FLIM। PNs ਦੀ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਰੈਡੌਕਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਬਦਲਾਅ ਸੈਜਿਟਲ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੋ-ਫੋਟੋਨ FLIM ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿੱਥੇ Grx1-roGFP2 ਬਾਇਓਸੈਂਸਰ ਨੇ PNs ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਇਆ ਸੀ। PN ਪਰਤ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਸਲਾਈਸ ਸਤਹ ਤੋਂ ਲਗਭਗ 50 ਤੋਂ 80 μm ਹੇਠਾਂ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਇੱਕ ਵਿਵਹਾਰਕ PN ਹੈ (ਭਾਵ, ਡੈਂਡਰਾਈਟਸ ਦੇ ਨਾਲ ਮਣਕੇਦਾਰ ਢਾਂਚੇ ਜਾਂ ਨਿਊਰੋਨਲ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਘਾਟ) ਅਤੇ ਡਬਲ ਸਕਾਰਾਤਮਕ roGFP2 ਸੈਂਸਰ ਅਤੇ AAV ਏਨਕੋਡਿੰਗ shRNA PCx ਜਾਂ ਇਸਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਕ੍ਰਮ (ਹਰੇਕ ਸਹਿ-ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ mCherry)। 2x ਡਿਜੀਟਲ ਜ਼ੂਮ [ਉਤਸ਼ਾਹ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ: 890 nm; 512 nm 512 ਪਿਕਸਲ] ਨਾਲ ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਕ ਚਿੱਤਰ ਇਕੱਠੇ ਕਰੋ। ਖੋਜ: ਅੰਦਰੂਨੀ HyD, ਫਲੋਰੋਸੀਨ ਆਈਸੋਥਿਓਸਾਈਨੇਟ (FITC) ਫਿਲਟਰ ਸਮੂਹ] ਅਤੇ 2 ਤੋਂ 3 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਚਿੱਤਰ ਔਸਤ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕਰਵ ਫਿਟਿੰਗ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਫੋਟੌਨ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ (ਕੁੱਲ 1000 ਫੋਟੌਨ)। Grx1-roGFP2 ਪ੍ਰੋਬ ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ FLIM ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੀ ਤਸਦੀਕ roGFP2 ਦੇ ​​ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਮੁੱਲ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਜਦੋਂ ਪਰਫਿਊਜ਼ਨ ACSF ਵਿੱਚ ਬਾਹਰੀ 10 mM H2O2 ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ (ਆਕਸੀਕਰਨ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ), ਅਤੇ ਫਿਰ 2 mM ਡਾਇਥੀਓਥ੍ਰੀਟੋਲ (ਘਟਾਓ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ) ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ (ਚਿੱਤਰ S8, D ਤੋਂ G)। ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ FLIMfit 5.1.1 ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਪੂਰੇ ਚਿੱਤਰ ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਐਕਸਪੋਨੈਂਸ਼ੀਅਲ ਡਿਕੇ ਵਕਰ ਨੂੰ ਮਾਪੇ ਗਏ IRF (ਇੰਸਟ੍ਰੂਮੈਂਟ ਰਿਸਪਾਂਸ ਫੰਕਸ਼ਨ) ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ χ2 ਲਗਭਗ 1 ਹੈ। ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ PN ਦੇ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਨਰਵ ਬਾਡੀ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਮਾਸਕ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਖਿੱਚਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਮਾਸਕ ਵਿੱਚ ਔਸਤ ਜੀਵਨ ਕਾਲ ਨੂੰ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਸੰਭਾਵੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਤੀਬਰ ਭਾਗ ਨੂੰ 100 nM TMRM ਨਾਲ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਰਫਿਊਜ਼ਡ ACSF ਵਿੱਚ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, PNs ਦੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਸੰਭਾਵੀ ਬਦਲਾਅ ਨੂੰ ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। TMRM ਇਮੇਜਿੰਗ 920 nm 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਬ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਸਿਗਨਲ ਇਕੱਠੇ ਕਰਨ ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ HyD (ਟੈਟਰਾਮੇਥਾਈਲਰੋਡਾਮਾਈਨ ਆਈਸੋਥਿਓਸਾਈਨੇਟ: 585/40 nm) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ; ਉਸੇ ਉਤੇਜਨਾ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਰ mtYFP ਦੀ ਤਸਵੀਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਵੱਖਰੇ ਅੰਦਰੂਨੀ HyD (FITC :525/50) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ। ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਸੰਭਾਵੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ImageJ ਦੇ ਚਿੱਤਰ ਕੈਲਕੁਲੇਟਰ ਪਲੱਗ-ਇਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਪਲੱਗ-ਇਨ ਸਮੀਕਰਨ: ਸਿਗਨਲ = ਮਿੰਟ (mtYFP, TMRM) ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਸੰਬੰਧਿਤ ਚੈਨਲ ਦੇ ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਕ ਕਨਫੋਕਲ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਪੁਰਕਿਨਜੇ ਸੋਮਾਲੀ ਵਿੱਚ TMRM ਸਿਗਨਲ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮਾਸਕ ਵਿੱਚ ਪਿਕਸਲ ਖੇਤਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ mtYFP ਚੈਨਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਕ ਚਿੱਤਰ 'ਤੇ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਸੰਭਾਵੀਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।
ਚਿੱਤਰ ਨੂੰ ਹਿਊਜੇਨਸ ਪ੍ਰੋ (ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ ਵਾਲੀਅਮ ਇਮੇਜਿੰਗ) ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਨਾਲ ਡੀਕੰਵੋਲਿਊਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਟਾਈਲਾਂ ਦੀਆਂ ਸਕੈਨ ਕੀਤੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਲਈ, LAS-X ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸਿਲਾਈ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਟਾਈਲ ਦਾ ਮੋਂਟੇਜ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਚਿੱਤਰ ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਚਿੱਤਰ ਨੂੰ ਅੱਗੇ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਚਮਕ ਅਤੇ ਕੰਟ੍ਰਾਸਟ ਨੂੰ ਇਕਸਾਰ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵਿਵਸਥਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ImageJ ਅਤੇ Adobe Photoshop ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਗ੍ਰਾਫਿਕ ਤਿਆਰੀ ਲਈ Adobe Illustrator ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
mtDNA ਫੋਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੁਆਰਾ DNA ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਭਾਗਾਂ 'ਤੇ mtDNA ਜਖਮਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ ਟੀਚਾ ਖੇਤਰ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਸੈੱਲ ਦੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਲਈ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਖੇਤਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਮਲਟੀ ਮੇਜ਼ਰ ਪਲੱਗ-ਇਨ (ImageJ ਸਾਫਟਵੇਅਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਖੇਤਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸੈੱਲ ਬਾਡੀ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਖੇਤਰ ਘਟਾਓ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਣ ਪਲੱਗ-ਇਨ (ImageJ ਸਾਫਟਵੇਅਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਚਿੱਤਰ 'ਤੇ mtDNA ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ DNA ਬਿੰਦੂਆਂ ਨੂੰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਮਾਪਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ CTRL ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ PN ਔਸਤ ਤੱਕ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀ ਸੈੱਲ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਦੀ ਔਸਤ ਗਿਣਤੀ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਪੱਧਰ 'ਤੇ PN ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ImageJ ਦੇ ਇਮੇਜ ਕੈਲਕੁਲੇਟਰ ਪਲੱਗ-ਇਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੰਬੰਧਿਤ ਚੈਨਲ ਦੇ ਸਿੰਗਲ-ਲੇਅਰ ਕਨਫੋਕਲ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ, ਸਮੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ: ਸਿਗਨਲ = ਘੱਟੋ-ਘੱਟ (mtYFP, ਐਂਟੀਬਾਡੀ), ਪੁਰਕਿਨ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਖਾਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨੂੰ ਇਮਯੂਨੋਰੀਐਕਟੀਵਿਟੀ ਦਿਖਾਉਣ ਵਾਲੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਖੇਤਰ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਫਿਰ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮਾਸਕ ਵਿੱਚ ਪਿਕਸਲ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਅੰਸ਼ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ mtYFP ਚੈਨਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਕ ਚਿੱਤਰ 'ਤੇ ਸਧਾਰਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਘਣਤਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਇਮੇਜਜੇ ਦੇ ਸੈੱਲ ਕਾਊਂਟਰ ਪਲੱਗ-ਇਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਘਣਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਗਿਣੇ ਗਏ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਨੂੰ ਗਿਣੇ ਗਏ ਸੈੱਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਕਬਜ਼ੇ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਰਿੰਗ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨਾਲ ਵੰਡ ਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਨਮੂਨਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨਾ। ਕੰਟਰੋਲ ਗਰੁੱਪ ਅਤੇ Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ 0.1 M ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ (PB) ਵਿੱਚ 2% PFA/2.5% ਗਲੂਟਾਰਾਲਡੀਹਾਈਡ ਵਿੱਚ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਕੋਰੋਨਲ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਸਿਲੀਏਟਸ (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (ਮੋਟਾਈ 50 ਤੋਂ 60 μm) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1% os ਟੈਟਰਾਆਕਸਾਈਡ ਅਤੇ 1.5% ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਫੈਰੋਸਾਈਨਾਈਡ ਵਿੱਚ PB ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਫਿਕਸ ਕਰੋ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਡਿਸਟਿਲਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 1% ਯੂਰੇਨਾਇਲ ਐਸੀਟੇਟ ਵਾਲੇ 70% ਈਥਾਨੌਲ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ। ਫਿਰ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਗ੍ਰੇਡ ਕੀਤੇ ਅਲਕੋਹਲ ਵਿੱਚ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਡਰਕੁਪਨ ACM (Araldite ਕਾਸਟਿੰਗ ਰੈਜ਼ਿਨ M) ਈਪੌਕਸੀ ਰੈਜ਼ਿਨ (ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਸਾਇੰਸਜ਼, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 14040) ਵਿੱਚ ਸਿਲੀਕਾਨ-ਕੋਟੇਡ ਕੱਚ ਦੀਆਂ ਸਲਾਈਡਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ 60°C 'ਤੇ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਓਵਨ ਵਿੱਚ ਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੇਰੀਬੇਲਰ ਕਾਰਟੈਕਸ ਖੇਤਰ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਲੀਕਾ ਅਲਟਰਾਕਟ (ਲੀਕਾ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ ਜੀਐਮਬੀਐਚ, ਵਿਯੇਨ੍ਨਾ, ਆਸਟਰੀਆ) 'ਤੇ 50 ਐਨਐਮ ਅਲਟਰਾਥਿਨ ਭਾਗ ਕੱਟੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਪੋਲੀਸਟਾਈਰੀਨ ਫਿਲਮ ਨਾਲ ਲੇਪ ਕੀਤੇ 2×1 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਤਾਂਬੇ ਦੇ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਗਰਿੱਡ 'ਤੇ ਚੁਣੇ ਗਏ ਸਨ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ H2O ਵਿੱਚ 4% ਯੂਰੇਨਾਇਲ ਐਸੀਟੇਟ ਦੇ ਘੋਲ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਕਈ ਵਾਰ H2O ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ H2O ਵਿੱਚ ਰੇਨੋਲਡਸ ਲੀਡ ਸਿਟਰੇਟ ਨਾਲ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਕਈ ਵਾਰ H2O ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਫਿਲਿਪਸ CM100 (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਵਾਲਥਮ, ਐਮਏ, ਯੂਐਸਏ) ਨਾਲ ਇੱਕ TVIPS (Tietz ਵੀਡੀਓ ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਸਿਸਟਮ) TemCam-F416 ਡਿਜੀਟਲ ਕੈਮਰਾ (TVIPS GmbH, ਗੌਟਿੰਗ, ਯੂਐਸਏ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਲਏ ਗਏ ਸਨ। ਜਰਮਨੀ)।
AAV ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਚੂਹਿਆਂ ਲਈ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 1 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਮੋਟੇ ਸੈਜਿਟਲ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ AAV-ਸੰਕਰਮਿਤ ਰਿੰਗ (ਭਾਵ, mCherry ਐਕਸਪ੍ਰੈਸਿੰਗ) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੇਰੀਬੈਲਮ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸਿਰਫ਼ ਉਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ AAV ਟੀਕੇ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਲਗਾਤਾਰ ਸੇਰੀਬੈਲਰ ਰਿੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲ ਪਰਤ (ਭਾਵ ਲਗਭਗ ਪੂਰੀ ਪਰਤ) ਦੀ ਬਹੁਤ ਉੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਡਕਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। AAV-ਟ੍ਰਾਂਸਡਿਊਸਡ ਲੂਪ ਨੂੰ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਪੋਸਟ-ਫਿਕਸੇਸ਼ਨ (4% PFA ਅਤੇ 0.1 M ਕੋਕੋਟ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 2.5% ਗਲੂਟਾਰਾਲਡੀਹਾਈਡ) ਲਈ ਮਾਈਕ੍ਰੋਡਿਸੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਅੱਗੇ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। EPON ਏਮਬੈਡਿੰਗ ਲਈ, ਸਥਿਰ ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ 0.1 M ਸੋਡੀਅਮ ਕੋਕੋਟ ਬਫਰ (ਐਪਲੀਚੇਮ) ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ 0.1 M ਸੋਡੀਅਮ ਕੋਕੋਟ ਬਫਰ (ਐਪਲੀਚੇਮ) ਵਿੱਚ 2% OsO4 (os, ਸਾਇੰਸ ਸਰਵਿਸਿਜ਼; Caco) ਨਾਲ 4 ਘੰਟੇ ਇੰਕੂਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਧੋਵੋ। 0.1 M ਕੋਕਾਮਾਈਡ ਬਫਰ ਨਾਲ 3 ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਓ। ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ ਡੀਹਾਈਡ੍ਰੇਟ ਕਰਨ ਲਈ ਹਰੇਕ ਈਥਾਨੌਲ ਘੋਲ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਨ ਲਈ ਈਥਾਨੌਲ ਦੀ ਚੜ੍ਹਦੀ ਲੜੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਪੀਲੀਨ ਆਕਸਾਈਡ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ EPON (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਵਿੱਚ ਰਾਤ ਭਰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਟਿਸ਼ੂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਤਾਜ਼ੇ EPON ਵਿੱਚ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਰੱਖੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ 62°C 'ਤੇ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਏਮਬੇਡ ਕਰੋ। 70 nm ਅਲਟਰਾਥਿਨ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਕੱਟਣ ਲਈ ਇੱਕ ਅਲਟਰਾਮਾਈਕ੍ਰੋਟੋਮ (ਲੀਕਾ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਿਸਟਮ, UC6) ਅਤੇ ਇੱਕ ਹੀਰਾ ਚਾਕੂ (ਡਾਇਟੋਮ, ਬੀਲ, ਸਵਿਟਜ਼ਰਲੈਂਡ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 1.5% ਯੂਰੇਨਾਇਲ ਐਸੀਟੇਟ ਨਾਲ ਦਾਗ ਲਗਾਓ, ਅਤੇ 4 ਮਿੰਟ ਲਈ ਲੀਡ ਸਾਈਟਰੇਟ ਘੋਲ ਨਾਲ ਦਾਗ ਲਗਾਓ। ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਕੈਮਰਾ ਵਨਵਿਊ 4K 16-ਬਿੱਟ (ਗੈਟਨ) ਅਤੇ ਡਿਜੀਟਲਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਗੈਟਨ) ਨਾਲ ਲੈਸ JEM-2100 ਪਲੱਸ ਟ੍ਰਾਂਸਮਿਸ਼ਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (JEOL) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਏ ਗਏ ਸਨ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ 5000× ਜਾਂ 10,000× ਡਿਜੀਟਲ ਜ਼ੂਮ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦਾ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਸਾਰੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਲਈ, ਇਮੇਜਜੇ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡਿਜੀਟਲ ਚਿੱਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੇ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਘਣਤਾ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਸੈੱਲ ਦੇ ਕੁੱਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਖੇਤਰ (ਸਾਈਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਖੇਤਰ = ਸੈੱਲ ਖੇਤਰ-ਸੈੱਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਖੇਤਰ) × 100 ਦੁਆਰਾ ਵੰਡ ਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੀ ਗੋਲਾਈ ਦੀ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ [4π∙(ਖੇਤਰ/ਘੇਰਾ 2)] ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੇ ਇਸਟਾ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਮੁੱਖ ਆਕਾਰਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਦੋ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ("ਟਿਊਬੂਲਰ" ਅਤੇ "ਛਾਲੇ") ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਸੰਖਿਆ ਅਤੇ ਘਣਤਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਡਿਜੀਟਲ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਦੇ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਰੂਪਰੇਖਾ ਦੇਣ ਲਈ ImageJ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਸੈੱਲ ਦੇ ਕੁੱਲ ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਬਣਤਰ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਖੇਤਰ (ਸਾਈਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਖੇਤਰ = ਸੈੱਲ ਖੇਤਰ-ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਖੇਤਰ) × 100 ਦੁਆਰਾ ਵੰਡ ਕੇ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਦੀ ਘਣਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੁੱਲ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀ ਸੈੱਲ ਆਟੋਫੈਗੋਸੋਮ/ਲਾਇਸੋਸੋਮ ਬਣਤਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ (ਸਾਈਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਖੇਤਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ) (ਸਾਈਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਖੇਤਰ = ਸੈੱਲ ਖੇਤਰ-ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਖੇਤਰ) ਨਾਲ ਵੰਡ ਕੇ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
ਐਕਿਊਟ ਸੈਕਸ਼ਨਿੰਗ ਅਤੇ ਸੈਂਪਲ ਤਿਆਰੀ ਲਈ ਲੇਬਲਿੰਗ। ਉਹਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਲਈ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਐਕਿਊਟ ਬ੍ਰੇਨ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰੀ-ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੰਤ੍ਰਿਪਤ ਕਾਰਬਨ (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2), ਉੱਚ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ਗਲੂਕੋਜ਼, 1.0 mM CaCl2 ਅਤੇ 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 ਅਤੇ 310 ਤੋਂ 320 mOsm ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ), ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਗਲੂਕੋਜ਼ 13 C 6- ਗਲੂਕੋਜ਼ ਬਦਲ (ਯੂਰੀਸੋਟੌਪ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ CLM-1396) ਹੈ। ਉਹਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਲਈ ਪਾਈਰੂਵੇਟ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਐਕਿਊਟ ਬ੍ਰੇਨ ਸਲਾਈਸ ਨੂੰ ਉੱਚ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ਗਲੂਕੋਜ਼, 1.0 mM CaCl2) ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ ਅਤੇ 2.0 mM MgCl2 ਜੋੜੋ, pH 7.4 ਅਤੇ 310 ਤੋਂ 320mOsm ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ 1 mM 1-[1-13C] ਪਾਈਰੂਵੇਟ (ਯੂਰੀਸੋਟੌਪ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ CLM-1082) ਜੋੜੋ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 37°C 'ਤੇ 90 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਅੰਤ 'ਤੇ, ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 75 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਕਾਰਬੋਨੇਟ ਵਾਲੇ ਜਲਮਈ ਘੋਲ (pH 7.4) ਨਾਲ ਜਲਦੀ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ 40:40:20 (v:v:v) ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ (ACN): ਮੀਥੇਨੌਲ: ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 21,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਸਾਫ਼ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਸਪੀਡਵੈਕ ਕੰਸੈਂਟਰੇਟਰ ਵਿੱਚ ਸੁਕਾਇਆ ਗਿਆ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸੁੱਕੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੱਕ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
13 C-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਦਾ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ-ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ-ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (LC-MS) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ 75μl LC-MS ਗ੍ਰੇਡ ਪਾਣੀ (ਹਨੀਵੈੱਲ) ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 4°C 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 21,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਪਸ਼ਟ ਕੀਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਦੇ 20 μl ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਫਲਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਬਾਕੀ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਨੂੰ ਤੁਰੰਤ ਐਨੀਅਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਹੇਠਾਂ ਦੇਖੋ)। ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਬੈਂਜੋਇਲ ਕਲੋਰਾਈਡ ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ (55, 56) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਹਿਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ, 100 mM ਸੋਡੀਅਮ ਕਾਰਬੋਨੇਟ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਦਾ 10μl ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਦੇ 20μl ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 2% ਬੈਂਜੋਇਲ ਕਲੋਰਾਈਡ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਦਾ 10μl LC ਗ੍ਰੇਡ ACN ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਵੌਰਟੈਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਫਿਰ 20°C 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 21,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਾਫ਼ ਕੀਤੇ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਕੋਨਿਕਲ ਗਲਾਸ ਇਨਸਰਟ (200 μl ਵਾਲੀਅਮ) ਨਾਲ 2 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਆਟੋਸੈਂਪਲਰ ਸ਼ੀਸ਼ੀ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ। ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ Q-Exactive (QE)-HF (ਅਲਟਰਾ ਹਾਈ ਫੀਲਡ ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ) ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਐਕੁਇਟੀ ਆਈਕਲਾਸ ਅਲਟਰਾ-ਹਾਈ ਪਰਫਾਰਮੈਂਸ LC ਸਿਸਟਮ (ਵਾਟਰਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਡੈਰੀਵੇਟਾਈਜ਼ਡ ਨਮੂਨੇ ਦੇ 2μl ਨੂੰ 100×1.0 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਉੱਚ-ਸ਼ਕਤੀ ਵਾਲੇ ਸਿਲਿਕਾ T3 ਕਾਲਮ (ਵਾਟਰਸ) ਵਿੱਚ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1.8μm ਕਣ ਸਨ। ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 100μl/ਮਿੰਟ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਫਰ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਬਫਰ A (10 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਫਾਰਮੇਟ ਅਤੇ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ 0.15% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਅਤੇ ਬਫਰ B (ACN) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਹੈ: 0 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 0%B; 0%B। 0 ਤੋਂ 0.1 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 0 ਤੋਂ 15% B; 0.1 ਤੋਂ 0.5 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 15 ਤੋਂ 17% B; 0.5 ਤੋਂ 14 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 17 ਤੋਂ 55% B; 14 ਤੋਂ 14.5 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 55 ਤੋਂ 70% B; 14.5 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 14.5 ਤੋਂ 70 ਤੋਂ 100% B; 18 ਤੋਂ 19 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 100% B; 19 ਤੋਂ 19.1 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 100 ਤੋਂ 0% B; 19.1 ਤੋਂ 28 ਮਿੰਟ 'ਤੇ 0% B (55, 56)। QE-HF ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ 50 ਤੋਂ 750 ਦੀ m/z (ਮਾਸ/ਚਾਰਜ ਅਨੁਪਾਤ) ਦੀ ਪੁੰਜ ਰੇਂਜ ਦੇ ਨਾਲ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 60,000 ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਗੇਨ ਕੰਟਰੋਲ (AGC) ਆਇਨ ਟੀਚਾ 3×106 ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਆਇਨ ਸਮਾਂ 100 ਮਿਲੀਸਕਿੰਟ ਹੈ। ਗਰਮ ਕੀਤਾ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ (ESI) ਸਰੋਤ 3.5 kV ਦੇ ਸਪਰੇਅ ਵੋਲਟੇਜ, 250°C ਦੇ ਕੇਸ਼ੀਲ ਤਾਪਮਾਨ, 60 AU (ਆਰਬਿਟਰੀ ਯੂਨਿਟਾਂ) ਦੇ ਇੱਕ ਸ਼ੀਥ ਏਅਰਫਲੋ, ਅਤੇ 20 AU. 250°C ਦੇ ਇੱਕ ਸਹਾਇਕ ਏਅਰਫਲੋ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। S ਲੈਂਸ 60 AU 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਹੈ।
13C ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਜੈਵਿਕ ਐਸਿਡਾਂ ਦਾ ਐਨੀਅਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ-ਐਮਐਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਬਾਕੀ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਪ੍ਰੀਪੀਕੇਟ (55μl) ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ ਡਾਇਓਨੈਕਸ ਆਇਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਸਿਸਟਮ (ICS 5000+, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਇੱਕ QE-HF ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, 5μl ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਨੂੰ 1 ਦੇ ਫਿਲਿੰਗ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਨਾਲ ਪੁਸ਼-ਇਨ ਪਾਰਸ਼ਲ ਲੂਪ ਮੋਡ ਵਿੱਚ HPLC (2 mm×250 mm, ਕਣ ਆਕਾਰ 4μm, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਡਾਇਓਨੈਕਸ ਆਇਨਪੈਕ AS11-HC ਕਾਲਮ ਵਿੱਚ ਇੰਜੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ) ਡਾਇਓਨੈਕਸ ਆਇਨਪੈਕ AG11-HC ਗਾਰਡ ਕਾਲਮ (2 mm x 50 mm, 4μm, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ)। ਕਾਲਮ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 30°C 'ਤੇ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਆਟੋਸੈਂਪਲਰ 6°C 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਐਲੂਐਂਟ ਜਨਰੇਟਰ ਰਾਹੀਂ ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਡ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਡ ਕਾਰਟ੍ਰੀਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। 380μl/ਮਿੰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 'ਤੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨਾ, ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨੂੰ ਲਾਗੂ ਕਰਨਾ: 0 ਤੋਂ 3 ਮਿੰਟ, 10 mM KOH; 3 ਤੋਂ 12 ਮਿੰਟ, 10 ਤੋਂ 50 mM KOH; 12 ਤੋਂ 19 ਮਿੰਟ, 50 ਤੋਂ 100 mM KOH; 19 ਤੋਂ 21 ਮਿੰਟ, 100 mM KOH; 21 ਤੋਂ 21.5 ਮਿੰਟ, 100 ਤੋਂ 10 mM KOH। ਕਾਲਮ ਨੂੰ 8.5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 10 mM KOH ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਦੁਬਾਰਾ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਲੂਟਿਡ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਨੂੰ ਕਾਲਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 150μl/ਮਿੰਟ ਆਈਸੋਪ੍ਰੋਪਾਨੋਲ ਸਪਲੀਮੈਂਟ ਸਟ੍ਰੀਮ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਨੈਗੇਟਿਵ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਕੰਮ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਵੱਲ ਭੇਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। MS 60,000 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ m/z 50 ਤੋਂ 750 ਤੱਕ ਪੁੰਜ ਰੇਂਜ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰ ਰਿਹਾ ਹੈ। AGC 1×106 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਆਇਨ ਸਮਾਂ 100 ms 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਗਰਮ ਕੀਤੇ ESI ਸਰੋਤ ਨੂੰ 3.5 kV ਦੇ ਸਪਰੇਅ ਵੋਲਟੇਜ 'ਤੇ ਚਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਆਇਨ ਸਰੋਤ ਦੀਆਂ ਹੋਰ ਸੈਟਿੰਗਾਂ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਹਨ: ਕੇਸ਼ੀਲ ਤਾਪਮਾਨ 275°C; ਸ਼ੀਥ ਗੈਸ ਪ੍ਰਵਾਹ, 60 AU; ਸਹਾਇਕ ਗੈਸ ਪ੍ਰਵਾਹ, 300°C 'ਤੇ 20 AU, ਅਤੇ S ਲੈਂਸ 60 AU 'ਤੇ ਸੈਟਿੰਗ।
13C ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟਸ ਦਾ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਆਈਸੋਟੋਪ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਟਰੇਸਫਾਈਂਡਰ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (ਵਰਜਨ 4.2, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਹਰੇਕ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੀ ਪਛਾਣ ਇੱਕ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਸੰਦਰਭ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਆਈਸੋਟੋਪ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਹਰੇਕ 13C ਆਈਸੋਟੋਪ (Mn) ਦੇ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕੀਤੇ ਆਇਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਮ (XIC) ਦਾ ਖੇਤਰ [M + H] + ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿੱਥੇ n ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦਾ ਕਾਰਬਨ ਨੰਬਰ ਹੈ, ਜੋ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ [MH] + ਐਨੀਅਨਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। XIC ਦੀ ਪੁੰਜ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਪ੍ਰਤੀ ਮਿਲੀਅਨ ਪੰਜ ਹਿੱਸੇ ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਅਤੇ RT ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ 0.05 ਮਿੰਟ ਹੈ। ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਹਰੇਕ ਖੋਜੇ ਗਏ ਆਈਸੋਟੋਪ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੇ ਸਾਰੇ ਆਈਸੋਟੋਪਾਂ ਦੇ ਜੋੜ ਨਾਲ ਗਣਨਾ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਅਨੁਪਾਤ ਹਰੇਕ ਆਈਸੋਟੋਪ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਮੁੱਲਾਂ ਵਜੋਂ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਮੋਲਰ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਸੰਸ਼ੋਧਨ (MPE) ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (42)।
ਜੰਮੇ ਹੋਏ ਨਿਊਰੋਨ ਪੈਲੇਟ ਨੂੰ ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ 80% ਮੀਥੇਨੌਲ (v/v) ਵਿੱਚ ਸਮਰੂਪ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਵੌਰਟੈਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ -20°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਘੁੰਮਾਓ ਅਤੇ +4°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਹਿਲਾਓ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 21,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ 25°C 'ਤੇ ਸਪੀਡਵੈਕ ਕੰਸੈਂਟਰੇਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੁਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ 'ਤੇ LC-MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। TraceFinder (ਵਰਜਨ 4.2, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਹਰੇਕ ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੇ ਮੋਨੋਇਸੋਟੋਪਿਕ ਪੁੰਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੀਪ੍ਰੋਸੈਸਕੋਰ ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ (57) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਟ ਡੇਟਾ ਦਾ ਕੁਆਂਟਾਈਲ ਸਧਾਰਣਕਰਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਤਿਆਰੀ। ਚੂਹੇ ਨੂੰ ਕਾਰਬਨ ਡਾਈਆਕਸਾਈਡ ਨਾਲ ਜਲਦੀ ਬੇਹੋਸ਼ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਿਰ ਕੱਟ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਜਲਦੀ ਹੀ ਖੋਪੜੀ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਬਰਫ਼ ਨਾਲ ਭਰੇ ਵਾਈਬ੍ਰੇਟਿੰਗ ਚਾਕੂ (HM-650 V, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਵਾਲਡੋਰਫ, ਜਰਮਨੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਸਨੂੰ 300 ਤੋਂ 375 μm ਸੈਜਿਟਲ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਕੱਟਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਠੰਡਾ ਕਾਰਬਨ ਗੈਸੀਫਿਕੇਸ਼ਨ (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2) ਘੱਟ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ਗਲੂਕੋਜ਼, 1.0 mM CaCl2 ਅਤੇ 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 ਅਤੇ 310 ਤੋਂ 330 mOsm ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕਰੋ)। ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਉੱਚ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ਸੋਡੀਅਮ ਫਾਸਫੇਟ ਬਫਰ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ਗਲੂਕੋਜ਼, 4.0 mM CaCl2 ਅਤੇ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ਅਤੇ 310 ਤੋਂ 320 mOsm ਹੋਵੇ। ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ 20 ਤੋਂ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸਟੋਰ ਕਰੋ ਤਾਂ ਜੋ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।
ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ। ਸਾਰੀਆਂ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਫਿਕਸਡ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਚੈਂਬਰ ਅਤੇ 20x ਵਾਟਰ ਇਮਰਸ਼ਨ ਆਬਜੈਕਟਿਵ ਲੈਂਸ (Scientifica) ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਸਟੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪੁਟੇਟਿਵ ਪੁਰਕਿੰਜੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ (i) ਸਰੀਰ ਦੇ ਆਕਾਰ, (ii) ਸੇਰੀਬੈਲਮ ਦੀ ਸਰੀਰਿਕ ਸਥਿਤੀ, ਅਤੇ (iii) ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ mtYFP ਰਿਪੋਰਟਰ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। 5 ਤੋਂ 11 ਮੇਗੋਹਮ ਦੇ ਟਿਪ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਵਾਲੇ ਪੈਚ ਪਾਈਪੇਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਬੋਰੋਸਿਲੀਕੇਟ ਗਲਾਸ ਕੇਸ਼ਿਕਾ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, ਸਾਇੰਸ ਪ੍ਰੋਡਕਟਸ, ਹੋਫਹਾਈਮ, ਜਰਮਨੀ) ਅਤੇ ਇੱਕ ਹਰੀਜੱਟਲ ਪਾਈਪੇਟ ਇੰਸਟਰੂਮੈਂਟਸ (P-1000, ਸਟਰ), ਨੋਵਾਟੋ, CA) ਦੁਆਰਾ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਾਰੀਆਂ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ELC-03XS npi ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਐਂਪਲੀਫਾਇਰ (npi ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ GmbH, Tam, ਜਰਮਨੀ) ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ, ਜਿਸਨੂੰ ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਸਿਗਨਲ (ਵਰਜਨ 6.0, ਕੈਂਬਰਿਜ ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ, ਕੈਂਬਰਿਜ, ਯੂਕੇ) ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰਯੋਗ 12.5 kHz ਦੀ ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਦਰ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਦੋ ਸ਼ਾਰਟ-ਪਾਸ ਬੇਸਲ ਫਿਲਟਰਾਂ ਨਾਲ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੀ ਕਟਆਫ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1.3 ਅਤੇ 10 kHz ਹੈ। ਝਿੱਲੀ ਅਤੇ ਪਾਈਪੇਟ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਐਂਪਲੀਫਾਇਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਸਰਕਟ ਦੁਆਰਾ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਇੱਕ ਓਰਕਾ-ਫਲੈਸ਼ 4.0 ਕੈਮਰੇ (ਹਮਾਮਾਤਸੂ, ਗਰਡਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਹੇਠ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਸਨੂੰ ਹੋਕਾਵੋ ਸਾਫਟਵੇਅਰ (ਵਰਜਨ 2.8, ਹਮਾਮਾਤਸੂ, ਗਰਡਨ, ਜਰਮਨੀ) ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਰੁਟੀਨ ਪੂਰੇ ਸੈੱਲ ਸੰਰਚਨਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਪਹਿਲਾਂ, ਪਾਈਪੇਟ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਪਦਾਰਥਾਂ ਵਾਲੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਘੋਲ ਨਾਲ ਭਰੋ: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਗਲੂਕੋਨੇਟ, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ਅਤੇ 10.0 mM creatinine phosphate ਨੂੰ pH 7.25 ਵਿੱਚ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਔਸਮੋਟਿਕ ਦਬਾਅ 290 mOsm (sucrose) ਸੀ। ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਫਟਣ ਲਈ 0 pA ਦੀ ਸ਼ਕਤੀ ਲਾਗੂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਬਾਅਦ, ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਨਪੁਟ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਨੂੰ -40, -30, -20, ਅਤੇ -10 pA ਦੇ ਹਾਈਪਰਪੋਲਰਾਈਜ਼ਡ ਕਰੰਟ ਲਗਾ ਕੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਵੋਲਟੇਜ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਮਾਪੋ ਅਤੇ ਇਨਪੁਟ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਓਹਮ ਦੇ ਨਿਯਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਇੱਕ ਵੋਲਟੇਜ ਕਲੈਂਪ ਵਿੱਚ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸਵੈ-ਚਾਲਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਅਤੇ sPSC ਨੂੰ ਇਗੋਰ ਪ੍ਰੋ (ਵਰਜਨ 32 7.01, ਵੇਵਮੈਟ੍ਰਿਕਸ, ਲੇਕ ਓਸਵੇਗੋ, ਓਰੇਗਨ, ਯੂਐਸਏ) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਅਰਧ-ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਪਛਾਣ ਸਕ੍ਰਿਪਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਛਾਣਿਆ ਅਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ। IV ਕਰਵ ਅਤੇ ਸਥਿਰ-ਅਵਸਥਾ ਕਰੰਟ ਨੂੰ ਬੈਟਰੀ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੰਭਾਵੀ (-110 mV ਤੋਂ ਸ਼ੁਰੂ) 'ਤੇ ਕਲੈਂਪ ਕਰਕੇ ਅਤੇ 5 mV ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਵੋਲਟੇਜ ਵਧਾ ਕੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। AP ਦੇ ਉਤਪਾਦਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਇੱਕ ਡੀਪੋਲਰਾਈਜ਼ਿੰਗ ਕਰੰਟ ਲਗਾ ਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਡੀਪੋਲਰਾਈਜ਼ਿੰਗ ਕਰੰਟ ਪਲਸ ਲਗਾਉਂਦੇ ਸਮੇਂ ਸੈੱਲ ਨੂੰ -70 mV 'ਤੇ ਕਲੈਂਪ ਕਰੋ। ਹਰੇਕ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਯੂਨਿਟ ਦੇ ਸਟੈਪ ਆਕਾਰ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ (10 ਤੋਂ 60 pA) ਵਿਵਸਥਿਤ ਕਰੋ। ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਦੀ ਗਣਨਾ ਪਲਸ ਸਪਾਈਕਸ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਗਿਣ ਕੇ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜੋ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੇ ਹਨ। AP ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਡੀਪੋਲਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪਲਸ ਦੇ ਦੂਜੇ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ ਇੱਕ ਜਾਂ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ AP ਨੂੰ ਚਾਲੂ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਛੇਦ ਕੀਤੇ ਪੈਚ ਸੰਰਚਨਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਮਿਆਰੀ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਛੇਦ ਕੀਤੇ ਪੈਚ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਕਰੋ। ਇੱਕ ATP- ਅਤੇ GTP-ਮੁਕਤ ਪਾਈਪੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਤੱਤ ਨਾ ਹੋਣ: 128 mM ਗਲੂਕੋਨੇਟ K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ਅਤੇ 2 mM MgCl2, ਅਤੇ pH 7.2 (KOH ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ) ਵਿੱਚ ਸਮਾਯੋਜਨ ਕਰੋ। ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਦੀ ਬੇਕਾਬੂ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀਤਾ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ATP ਅਤੇ GTP ਨੂੰ ਇੰਟਰਾਸੈਲੂਲਰ ਘੋਲ ਤੋਂ ਛੱਡ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪੈਚ ਪਾਈਪੇਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਐਮਫੋਟੇਰੀਸਿਨ-ਯੁਕਤ ਅੰਦਰੂਨੀ ਘੋਲ (ਲਗਭਗ 200 ਤੋਂ 250μg/ml; G4888, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਇੱਕ ਪੰਚ ਕੀਤਾ ਪੈਚ ਰਿਕਾਰਡ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। ਐਮਫੋਟੇਰੀਸਿਨ ਨੂੰ ਡਾਈਮੇਥਾਈਲ ਸਲਫੌਕਸਾਈਡ ਵਿੱਚ ਘੁਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ: 0.1 ਤੋਂ 0.3%; DMSO; D8418, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ)। ਵਰਤੇ ਗਏ DMSO ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਿਊਰੋਨਾਂ 'ਤੇ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਪਿਆ। ਪੰਚਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ, ਚੈਨਲ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ (Ra) ਦੀ ਲਗਾਤਾਰ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਅਤੇ Ra ਅਤੇ AP ਦੇ ਐਪਲੀਟਿਊਡ ਦੇ ਸਥਿਰ ਹੋਣ (20-40 ਮਿੰਟ) ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਯੋਗ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ 2 ਤੋਂ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਇੱਕ ਵੋਲਟੇਜ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਕਰੰਟ ਕਲੈਂਪ ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇਗੋਰ ਪ੍ਰੋ (ਵਰਜਨ 7.05.2, ਵੇਵਮੈਟ੍ਰਿਕਸ, ਯੂਐਸਏ), ਐਕਸਲ (ਵਰਜਨ 2010, ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਾਫਟ ਕਾਰਪੋਰੇਸ਼ਨ, ਰੈੱਡਮੰਡ, ਯੂਐਸਏ) ਅਤੇ ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ (ਵਰਜਨ 8.1.2, ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਇੰਕ., ਲਾ ਜੋਲਾ, ਸੀਏ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ APs ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਇਗੋਰਪ੍ਰੋ ਦੇ ਨਿਊਰੋਮੈਟਿਕ v3.0c ਪਲੱਗ-ਇਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਇੱਕ ਦਿੱਤੇ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ APs ਦੀ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਪਛਾਣ ਕਰੋ, ਜੋ ਹਰੇਕ ਰਿਕਾਰਡ ਲਈ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸਪਾਈਕ ਅੰਤਰਾਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ, ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਤਤਕਾਲ ਸਪਾਈਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਔਸਤ ਸਪਾਈਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਾਲ ਸਪਾਈਕ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ।
PN ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ। ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣ ਕੇ, PNs ਨੂੰ ਇੱਕ ਖਾਸ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਮਾਊਸ ਸੇਰੀਬੈਲਮ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (58)। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੇਰੀਬੈਲਮ ਨੂੰ ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ ਡਿਸਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਕੱਟਿਆ ਅਤੇ ਬਾਰੀਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ [HBSS Ca2+ ਅਤੇ Mg2+ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ, 20 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ (50 U/ml) ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (0.05 mg/ml) ਨਾਲ ਪੂਰਕ], ਅਤੇ ਫਿਰ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ papain [HBSS, 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ਅਤੇ deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml) ਨਾਲ ਪੂਰਕ] ਵਿੱਚ ਪਚਾਓ। 30°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਲਾਜ ਕਰੋ। ਪਹਿਲਾਂ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਨੂੰ HBSS ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਧੋਵੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅੰਡੇ ਦੇ ਬਲਗ਼ਮ (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ਅਤੇ DNase (0.1 mg/ml) ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਪਾਚਕ ਪਾਚਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ, ਅਤੇ ਫਿਰ 20 mM ਗਲੂਕੋਜ਼ ਵਾਲੇ HBSS ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ HBSS ਵਿੱਚ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਪੀਸ ਕੇ, ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ (50 U/ml), ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (0.05 mg/ml) ਅਤੇ DNase (0.1 mg/ml) ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਛੱਡਦੇ ਹਨ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ 70μm ਸੈੱਲ ਸਟਰੇਨਰ ਰਾਹੀਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ (1110 rpm, 5 ਮਿੰਟ, 4°C) ਦੁਆਰਾ ਪੈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਛਾਂਟੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ [HBSS, 20 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, 20% ਭਰੂਣ ਬੋਵਾਈਨ) ਸੀਰਮ, ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ (50 U/ml) ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (0.05 mg/ml)]; ਪ੍ਰੋਪੀਡੀਅਮ ਆਇਓਡਾਈਡ ਨਾਲ ਸੈੱਲ ਵਿਵਹਾਰਕਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰੋ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਘਣਤਾ ਨੂੰ 1×106 ਤੋਂ 2×106 ਸੈੱਲ/ml ਤੱਕ ਵਿਵਸਥਿਤ ਕਰੋ। ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੈਟਰੀ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ 50 μm ਸੈੱਲ ਸਟਰੇਨਰ ਰਾਹੀਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਸੀ।
ਫਲੋ ਸਾਇਟੋਮੀਟਰ। ਸੈੱਲ ਛਾਂਟੀ FACSAria III ਮਸ਼ੀਨ (BD ਬਾਇਓਸਾਇੰਸਿਜ਼) ਅਤੇ FACSDiva ਸੌਫਟਵੇਅਰ (BD ਬਾਇਓਸਾਇੰਸਿਜ਼, ਵਰਜਨ 8.0.1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 4°C 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ 100 μm ਨੋਜ਼ਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 20 psi ਦੇ ਦਬਾਅ ਹੇਠ ~2800 ਘਟਨਾਵਾਂ/ਸੈਕਿੰਡ ਦੀ ਦਰ ਨਾਲ ਛਾਂਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਿਉਂਕਿ ਰਵਾਇਤੀ ਗੇਟਿੰਗ ਮਾਪਦੰਡ (ਸੈੱਲ ਦਾ ਆਕਾਰ, ਬਾਈਮੋਡਲ ਵਿਤਕਰਾ, ਅਤੇ ਸਕੈਟਰਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ) ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਤੋਂ PN ਦੇ ਸਹੀ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਨਹੀਂ ਬਣਾ ਸਕਦੇ, ਇਸ ਲਈ ਗੇਟਿੰਗ ਰਣਨੀਤੀ mitoYFP+ ​​ਅਤੇ ਕੰਟਰੋਲ mitoYFP − ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ YFP ਤੀਬਰਤਾ ਅਤੇ ਆਟੋਫਲੋਰੇਸੈਂਸ ਦੀ ਸਿੱਧੀ ਤੁਲਨਾ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। YFP 488 nm ਲੇਜ਼ਰ ਲਾਈਨ ਨਾਲ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇਰੇਡੀਏਟ ਕਰਕੇ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ 530/30 nm ਬੈਂਡ ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। mitoYFP+ ​​ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ, Rosa26-mitoYFP ਰਿਪੋਰਟਰ ਜੀਨ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਤਾਕਤ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਿਊਰੋਨਲ ਬਾਡੀ ਅਤੇ ਐਕਸੋਨ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਵੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। 7-AAD ਨੂੰ 561 nm ਪੀਲੇ ਲੇਜ਼ਰ ਨਾਲ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਰੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਲਈ 675/20 nm ਬੈਂਡਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਨਾਲ ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਉਸੇ ਸਮੇਂ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ, ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ ACSA-2-APC ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਫਿਰ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 640 nm ਲੇਜ਼ਰ ਲਾਈਨ ਨਾਲ ਇਰੇਡੀਏਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ 660/20 nm ਬੈਂਡਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ (1110 rpm, 5 ਮਿੰਟ, 4°C) ਦੁਆਰਾ ਪੈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਵਰਤੋਂ ਤੱਕ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Mfn2cKO ਚੂਹਿਆਂ ਅਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਕੂੜੇ ਦੇ ਕਤੂਰਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਤਮਕ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਉਸੇ ਦਿਨ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। FACS ਡੇਟਾ ਪੇਸ਼ਕਾਰੀ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ FlowJo ਸੌਫਟਵੇਅਰ (FlowJo LLC, ਐਸ਼ਲੈਂਡ, ਓਰੇਗਨ, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (59), ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਐਮਟੀਡੀਐਨਏ ਕੁਆਂਟੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਲਈ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਨਿਊਰੋਨਸ ਤੋਂ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਰੇਖਿਕਤਾ ਅਤੇ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈੱਲਾਂ 'ਤੇ qPCR ਚਲਾ ਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, 50 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ-ਐਚਸੀਐਲ (ਪੀਐਚ 8.5), 1 ਐਮਐਮ ਈਡੀਟੀਏ, ​​0.5% ਟਵਿਨ 20 ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨੇਜ ਕੇ (200 ਐਨਜੀ/ਐਮਐਲ) ਵਾਲੇ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 300 ਪੀਐਨ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ ਅਤੇ 55 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 120 ਮਿੰਟ 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ। ਪ੍ਰੋਟੀਨੇਜ ਕੇ ਦੇ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੋਣ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਹੋਰ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। mt-Nd1 ਲਈ ਖਾਸ ਇੱਕ TaqMan ਪ੍ਰੋਬ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, mtDNA ਨੂੰ 7900HT ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਸਿਸਟਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਵਿੱਚ ਅਰਧ-ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਇੰਸ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ AIVI3E8) ਅਤੇ 18S (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ Hs99999901_s1) ਜੀਨ।
ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਨਮੂਨਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨਾ। ਘੋਲ ਨੂੰ 95°C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਗਰਮ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਸੋਨਿਕੇਟ ਕਰਕੇ, ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਵਿੱਚ [6 M ਗੁਆਨੀਡੀਨ ਕਲੋਰਾਈਡ, 10 mM ਟ੍ਰਿਸ (2-ਕਾਰਬੋਕਸਾਈਥਾਈਲ) ਫਾਸਫਾਈਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਲੋਰਾਈਡ, 10 mM ਕਲੋਰੋਐਸੀਟਾਮਾਈਡ ਅਤੇ 100 mM ਟ੍ਰਿਸ- HCl ਵਿੱਚ ਲਾਈਸ ਜੰਮੇ ਹੋਏ ਨਿਊਰੋਨ ਪੈਲੇਟਸ]। 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਬਾਇਓਰਪਟਰ (ਡਾਇਜੇਨੋਡ) 'ਤੇ (30 ਸਕਿੰਟ ਪਲਸ / 30 ਸਕਿੰਟ ਵਿਰਾਮ ਅਵਧੀ)। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 20 mM ਟ੍ਰਿਸ-HCl (pH 8.0) ਵਿੱਚ 1:10 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 300 ng ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਗੋਲਡ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ) ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਪਾਚਨ ਕਿਰਿਆ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਾਤ ਭਰ 37°C 'ਤੇ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੂਜੇ ਦਿਨ, ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 20,000 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਨੂੰ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਨਾਲ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਘੋਲ ਨੂੰ ਸਵੈ-ਨਿਰਮਿਤ ਸਟੇਜਟਿਪਸ ਨਾਲ ਡੀਸਲਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਪੀਡਵੈਕ ਯੰਤਰ (ਐਪੇਨਡੋਰਫ ਕੰਸੈਂਟਰੇਟਰ ਪਲੱਸ 5305) ਵਿੱਚ 45°C 'ਤੇ ਸੁਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪੇਪਟਾਈਡ ਨੂੰ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਵਿੱਚ ਮੁਅੱਤਲ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਰੇ ਨਮੂਨੇ ਇੱਕੋ ਵਿਅਕਤੀ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ, 4 μg ਡੀਸਾਲਟੇਡ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਟੈਂਡਮ ਮਾਸ ਟੈਗ (TMT10plex, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 90110, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸਦਾ ਪੇਪਟਾਈਡ ਤੋਂ TMT ਰੀਐਜੈਂਟ ਅਨੁਪਾਤ 1:20 ਸੀ। TMT ਲੇਬਲਿੰਗ ਲਈ, 0.8 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ TMT ਰੀਐਜੈਂਟ ਨੂੰ 70 μl ਐਨਹਾਈਡ੍ਰਸ ACN ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਸੁੱਕੇ ਪੇਪਟਾਈਡ ਨੂੰ 0.1 M TEAB (ਟ੍ਰਾਈਥਾਈਲਾਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ) ਦੇ 9 μl ਵਿੱਚ ਪੁਨਰਗਠਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ACN ਵਿੱਚ 7 ​​μl TMT ਰੀਐਜੈਂਟ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 43.75% ਸੀ। 60 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ 5% ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਲਾਮਾਈਨ ਦੇ 2 μl ਨਾਲ ਬੁਝਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਸੁੱਕੇ ਗਏ, 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (FA) ਦੇ 200μl ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਦੋ ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡੇ ਗਏ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸਵੈ-ਨਿਰਮਿਤ ਸਟੇਜਟਿਪਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੀਸਲਟ ਕੀਤੇ ਗਏ। UltiMate 3000 ਅਲਟਰਾ ਹਾਈ ਪਰਫਾਰਮੈਂਸ ਲਿਕਵਿਡ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫ (UltiMate 3000 ਅਲਟਰਾ ਹਾਈ ਪਰਫਾਰਮੈਂਸ ਲਿਕਵਿਡ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਦੋ ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਨੂੰ 130Å1.7μm C18 ਕਣਾਂ ਨਾਲ ਭਰੇ 1mm x 150mm ਐਕੁਇਟੀ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫਿਕ ਕਾਲਮ 'ਤੇ ਫਰੈਕਸ਼ਨੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (ਵਾਟਰਸ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ SKU: 186006935)। ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ)। 30μl/ਮਿੰਟ ਦੀ ਪ੍ਰਵਾਹ ਦਰ 'ਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰੋ, 1% ਤੋਂ 50% ਬਫਰ B ਤੋਂ 85 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 96 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਸਟੈਪਵਾਈਜ਼ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਵੱਖ ਕਰੋ, 50% ਤੋਂ 95% ਬਫਰ B ਤੋਂ 3 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ, ਫਿਰ 95% ਬਫਰ B ਲਈ 8 ਮਿੰਟ; ਬਫਰ A 5% ACN ਅਤੇ 10 mM ਅਮੋਨੀਅਮ ਬਾਈਕਾਰਬੋਨੇਟ (ABC) ਹੈ, ਅਤੇ ਬਫਰ B 80% ACN ਅਤੇ 10 mM ABC ਹੈ। ਹਰ 3 ਮਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਸ਼ ਇਕੱਠੇ ਕਰੋ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਦੋ ਸਮੂਹਾਂ (1 + 17, 2 + 18, ਆਦਿ) ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਵੈਕਿਊਮ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਵਿੱਚ ਸੁਕਾਓ।
LC-MS/MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਲਈ, ਪੇਪਟਾਇਡਸ (ਨੰਬਰ r119.aq) ਨੂੰ 25 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ, 75 μm ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ PicoFrit ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਕਾਲਮ (ਨਵਾਂ ਉਦੇਸ਼ ਲੈਂਜ਼, ਭਾਗ ਨੰਬਰ PF7508250) 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ਮਾਧਿਅਮ (ਡਾ. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਜਰਮਨੀ) ਨਾਲ ਲੈਸ ਸੀ। ਕਾਲਮ ਨੂੰ 50°C 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਫਰ A ਅਤੇ B ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ 80% ACN ਵਿੱਚ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਹਨ। ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ 65 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 6% ਤੋਂ 31% ਬਫਰ B ਤੋਂ ਅਤੇ 31% ਤੋਂ 50% ਬਫਰ B ਤੋਂ 5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 200 nl/ਮਿੰਟ ਦੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਲੂਟਿਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ ਫਿਊਜ਼ਨ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੇਪਟਾਇਡ ਪੂਰਵਗਾਮੀ m/z ਮਾਪ 350 ਤੋਂ 1500 m/z ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ 120,000 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। 27% ਸਧਾਰਣ ਟੱਕਰ ਊਰਜਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, 2 ਤੋਂ 6 ਦੀ ਚਾਰਜ ਸਥਿਤੀ ਵਾਲਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਉੱਚ ਊਰਜਾ C ਟ੍ਰੈਪ ਡਿਸਸੋਸੀਏਸ਼ਨ (HCD) ਕਲੀਵੇਜ ਲਈ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਚੱਕਰ ਸਮਾਂ 1 ਸਕਿੰਟ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਪੇਪਟਾਇਡ ਟੁਕੜੇ ਦਾ m/z ਮੁੱਲ 5×104 ਦੇ ਸਭ ਤੋਂ ਛੋਟੇ AGC ਟੀਚੇ ਅਤੇ 86 ms ਦੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਟੀਕੇ ਦੇ ਸਮੇਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਆਇਨ ਟ੍ਰੈਪ ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਨੂੰ 45 ਸਕਿੰਟ ਲਈ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਬੇਦਖਲੀ ਸੂਚੀ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। TMT-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ 50 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ, 75 μm ਐਕਲੇਮ ਪੇਪਮੈਪ ਕਾਲਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਕੈਟਾਲਾਗ ਨੰਬਰ 164942) 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਮਾਈਗ੍ਰੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟਰਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ ਔਰਬਿਟ੍ਰੈਪ ਲੂਮੋਸ ਟ੍ਰਾਈਬ੍ਰਿਡ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਹਾਈ-ਫੀਲਡ ਅਸਮੈਟ੍ਰਿਕ ਵੇਵਫਾਰਮ ਆਇਨਾਂ (FAIMS) ਉਪਕਰਣਾਂ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਨਾਲ ਲੈਸ ਹੈ। −50 ਅਤੇ −70 V ਦੇ ਦੋ ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਵੋਲਟੇਜ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਸਿੰਕ੍ਰੋਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪੂਰਵਗਾਮੀ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ MS3 TMT ਰਿਪੋਰਟ ਆਇਨ ਸਿਗਨਲ ਮਾਪ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪੇਪਟਾਇਡ ਵੱਖ ਕਰਨਾ EASY-nLC 1200 'ਤੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 90% ਲੀਨੀਅਰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਐਲੂਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, 6% ਤੋਂ 31% ਦੀ ਬਫਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ; ਬਫਰ A 0.1% FA ਸੀ, ਅਤੇ ਬਫਰ B 0.1% FA ਅਤੇ 80% ACN ਸੀ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਤਮਕ ਕਾਲਮ 50°C 'ਤੇ ਚਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। FAIMS ਮੁਆਵਜ਼ਾ ਵੋਲਟੇਜ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਸਲ ਫਾਈਲ ਨੂੰ ਵੰਡਣ ਲਈ ਫ੍ਰੀਸਟਾਈਲ (ਵਰਜਨ 1.6, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਕਰਨ। ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਐਂਡਰੋਮੇਡਾ ਖੋਜ ਇੰਜਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਮੂਲ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਮੈਕਸਕੁਆਇੰਟ ਸੰਸਕਰਣ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਏਕਿਊਰੀਆ ਵਿਕਟੋਰੀਆ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕ੍ਰੀ ਰੀਕੌਂਬੀਨੇਜ਼ ਅਤੇ YFP ਕ੍ਰਮਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪੇਪਟਾਇਡ ਫ੍ਰੈਗਮੈਂਟ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਮਾਊਸ ਰੈਫਰੈਂਸ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ (ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ ਆਈਡੀ UP000000589, ਮਈ 2017 ਵਿੱਚ ਯੂਨੀਪ੍ਰੋਟ ਤੋਂ ਡਾਊਨਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਦੇ ਕੈਨੋਨੀਕਲ ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ ਆਈਸੋਫਾਰਮ ਕ੍ਰਮ ਲਈ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਮੇਥਿਓਨਾਈਨ ਆਕਸੀਕਰਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ N-ਟਰਮੀਨਲ ਐਸੀਟਿਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵੇਰੀਏਬਲ ਸੋਧਾਂ ਵਜੋਂ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ; ਸਿਸਟੀਨ ਕਾਰਬਾਮੋਇਲ ਮਿਥਾਈਲੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਸੋਧਾਂ ਵਜੋਂ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਾਚਨ ਮਾਪਦੰਡ "ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ" ਅਤੇ "ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ/P" 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਛਾਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਅਤੇ ਰੇਜ਼ਰ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਗਿਣਤੀ 1 ਹੈ; ਵਿਲੱਖਣ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਗਿਣਤੀ 0 ਹੈ। ਪੇਪਟਾਇਡ ਨਕਸ਼ੇ ਦੇ ਮੇਲ ਦੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਛਾਣ ਦਰ 0.01 ਸੀ। "ਦੂਜਾ ਪੇਪਟਾਇਡ" ਵਿਕਲਪ ਸਮਰੱਥ ਹੈ। ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮੂਲ ਫਾਈਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਫਲ ਪਛਾਣਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਨ ਲਈ "ਰਨ ਵਿਚਕਾਰ ਮੇਲ" ਵਿਕਲਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਲੇਬਲ-ਮੁਕਤ ਮਾਤਰਾ (LFQ) (60) ਲਈ LFQ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਅਨੁਪਾਤ ਗਿਣਤੀ 1 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। LFQ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਸਮੇਂ ਬਿੰਦੂ 'ਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਇੱਕ ਜੀਨੋਟਾਈਪ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੋ ਵੈਧ ਮੁੱਲਾਂ ਲਈ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ 0.3 ਦੀ ਚੌੜਾਈ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਆਮ ਵੰਡ ਤੋਂ ਐਕਸਟਰਾਪੋਲੇਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 1.8 ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। LFQ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ Perseus ਕੰਪਿਊਟਿੰਗ ਪਲੇਟਫਾਰਮ (https://maxquant.net/perseus/) ਅਤੇ R (https://r-project.org/) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਲਿਮਾ ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ ਤੋਂ ਇੱਕ ਦੋ-ਪੱਖੀ ਮੱਧਮ t ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਡਿਫਰੈਂਸ਼ੀਅਲ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (61) ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਐਕਸਪਲੋਰੇਟਰੀ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ਅਤੇ phetmap ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। TMT-ਅਧਾਰਤ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ MaxQuant ਸੰਸਕਰਣ 1.6.10.43 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਯੂਨੀਪ੍ਰੋਟ ਦੇ ਮਨੁੱਖੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾਬੇਸ ਤੋਂ ਕੱਚੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰੋ, ਜੋ ਕਿ ਸਤੰਬਰ 2018 ਵਿੱਚ ਡਾਊਨਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਆਈਸੋਟੋਪ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਸੁਧਾਰ ਕਾਰਕ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ। ਵਿਭਿੰਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ R ਵਿੱਚ ਲਿਮਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਅਸਲ ਡੇਟਾ, ਡੇਟਾਬੇਸ ਖੋਜ ਨਤੀਜੇ, ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਰਕਫਲੋ ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਐਕਸਚੇਂਜ ਅਲਾਇੰਸ ਵਿੱਚ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਪਛਾਣਕਰਤਾ PXD019690 ਦੇ ਨਾਲ PRIDE ਪਾਰਟਨਰ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ ਰਾਹੀਂ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਅਮੀਰ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ। 8 ਹਫ਼ਤਿਆਂ (ਚਿੱਤਰ 1) 'ਤੇ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੇ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ ਸ਼ਬਦਾਂ ਦੀ ਅਮੀਰੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇਨਜੇਨੁਇਟੀ ਪਾਥਵੇਅ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (QIAGEN) ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, LC-MS/MS (ਟੈਂਡਮ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ) ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੂਚੀ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਫਿਲਟਰ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਨਾਲ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ: ਮਸ ਮਾਸਕੂਲਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਜਾਤੀ ਅਤੇ ਪਿਛੋਕੜ ਵਜੋਂ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸ਼੍ਰੇਣੀ 0.05 ਜਾਂ ਘੱਟ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਲਈ ਬੈਂਜਾਮਿਨੀ ਦੁਆਰਾ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤੇ P ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਗ੍ਰਾਫ ਲਈ, ਐਡਜਸਟ ਕੀਤੇ P ਮੁੱਲ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਹਰੇਕ ਕਲੱਸਟਰ ਵਿੱਚ ਚੋਟੀ ਦੀਆਂ ਪੰਜ ਵਾਧੂ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। ਮਲਟੀਪਲ ਟੀ-ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਬੈਂਜਾਮਿਨੀ, ਕ੍ਰੀਗਰ, ਅਤੇ ਯੇਕੁਟੀਏਲੀ (Q = 5%) ਦੇ ਦੋ-ਪੜਾਅ ਵਾਲੇ ਲੀਨੀਅਰ ਬੂਸਟ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਹਰੇਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਉਮੀਦਵਾਰਾਂ 'ਤੇ ਸਮਾਂ-ਕੋਰਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਕਤਾਰ ਦਾ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ ਇਕਸਾਰ SD ਅਪਣਾਉਣ ਦੀ ਕੋਈ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਡੇਟਾਬੇਸ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 1 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਵੇਨ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸੂਚੀ ਨੂੰ ਮਾਈਟੋਕਾਰਟਾ 2.0 ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ (24) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ। ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਔਨਲਾਈਨ ਟੂਲ ਡਰਾਅ ਵੇਨ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਅੰਕੜਾ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਬਾਰੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਭਾਗ ਨੂੰ ਵੇਖੋ। ਹੋਰ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਸੰਬੰਧਿਤ ਦੰਤਕਥਾ ਵਿੱਚ ਮਿਲ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਹੋਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ, ਸਾਰੇ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± SEM ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਗ੍ਰਾਫਪੈਡ ਪ੍ਰਿਜ਼ਮ 8.1.2 ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਇਸ ਲੇਖ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ਵੇਖੋ।
ਇਹ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਪਹੁੰਚ ਵਾਲਾ ਲੇਖ ਹੈ ਜੋ ਕਰੀਏਟਿਵ ਕਾਮਨਜ਼ ਐਟ੍ਰਬਿਊਸ਼ਨ-ਗੈਰ-ਵਪਾਰਕ ਲਾਇਸੈਂਸ ਦੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਧੀਨ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿਸੇ ਵੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਵਰਤੋਂ, ਵੰਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਅੰਤਿਮ ਵਰਤੋਂ ਵਪਾਰਕ ਲਾਭ ਲਈ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਆਧਾਰ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ ਕੰਮ ਸਹੀ ਹੈ। ਹਵਾਲਾ।
ਨੋਟ: ਅਸੀਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਆਪਣਾ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਦੇਣ ਲਈ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ ਤਾਂ ਜੋ ਜਿਸ ਵਿਅਕਤੀ ਨੂੰ ਤੁਸੀਂ ਪੰਨੇ 'ਤੇ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹੋ ਉਸਨੂੰ ਪਤਾ ਲੱਗੇ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ ਕਿ ਉਹ ਈਮੇਲ ਦੇਖੇ ਅਤੇ ਇਹ ਸਪੈਮ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕੋਈ ਵੀ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕਰਾਂਗੇ।
ਇਹ ਸਵਾਲ ਇਹ ਜਾਂਚਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਵਿਜ਼ਟਰ ਹੋ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸਪੈਮ ਸਬਮਿਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ਲਾਰਸਨ
ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਤਾ ਲੱਗਾ ਕਿ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦਾ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਨ ਲਈ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ਲਾਰਸਨ
ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਤਾ ਲੱਗਾ ਕਿ ਨਿਊਰੋਡੀਜਨਰੇਸ਼ਨ ਦਾ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਨ ਲਈ ਮੈਟਾਬੋਲਿਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
©2020 ਅਮੈਰੀਕਨ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਫਾਰ ਦ ਐਡਵਾਂਸਮੈਂਟ ਆਫ਼ ਸਾਇੰਸ। ਸਾਰੇ ਹੱਕ ਰਾਖਵੇਂ ਹਨ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ਅਤੇ COUNTER ਦਾ ਭਾਈਵਾਲ ਹੈ। ਸਾਇੰਸ ਐਡਵਾਂਸ ISSN 2375-2548।