ਮੌਜੂਦਾ†ਮੌਜੂਦਾ ਪਤਾ: OX11 0DE, ਯੂਕੇ, ਡਾਇਮੰਡ ਬਿਲਡਿੰਗ, ਹਾਰਵੈਲ ਸਾਇੰਸ ਐਂਡ ਇਨੋਵੇਸ਼ਨ ਪਾਰਕ, ​​ਡਾਇਟਕੋਟ, ਆਕਸਫੋਰਡਸ਼ਾਇਰ, ਯੂਕੇ, ਡਾਇਮੰਡ ਲਾਈਟ ਸੋਰਸ ਕੰਪਨੀ, ਲਿਮਟਿਡ, ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ ਬਾਇਓਲਾਜੀਕਲ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸੈਂਟਰ।
ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕੇਂਦਰ ਲਾਈਟ-ਹਾਰਵੈਸਟਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸ 1 (RC-LH1) ਜਾਮਨੀ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦਾ ਮੁੱਖ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਾਲਾ ਹਿੱਸਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਰੋਡੋਪਸੀਡੋਮੋਨਸ ਪੈਲਸਟ੍ਰਿਸ ਤੋਂ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਦੋ ਕ੍ਰਾਇਓ-ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਢਾਂਚੇ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ। RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ 2.65-Å ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ RC ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ 14 ਸਬਯੂਨਿਟ LH1 ਲੂਪ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਦੁਆਰਾ ਵਿਘਨ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਕੰਪਲੈਕਸ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ RC ਨਾਲ ਘਿਰਿਆ RC ਰਚਨਾ ਹੈ। ਬੰਦ 16 ਸਬਯੂਨਿਟ LH1 ਲੂਪ। ਇਹਨਾਂ ਢਾਂਚਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਕੁਇਨੋਨ ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸੂਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ RC QB ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਕੁਇਨੋਨ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਵੇਲੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਨਾਲ ਹੀ ਸਹਾਇਕ ਕੁਇਨੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ RC ਵਿੱਚ ਪਾਸ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦੇ ਹਨ। W ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਵਿਲੱਖਣ ਬਣਤਰ LH1 ਲੂਪ ਦੇ ਬੰਦ ਹੋਣ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਚੈਨਲ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।
ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਊਰਜਾ ਧਰਤੀ 'ਤੇ ਲਗਭਗ ਸਾਰੇ ਜੀਵਨ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਸੂਰਜੀ ਬਾਇਓਟੈਕਨਾਲੋਜੀ ਲਈ ਬਹੁਤ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ। ਗਲੋਬਲ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਜਾਮਨੀ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਊਰਜਾ ਮੋਡਾਂ ਅਤੇ ਪਾਚਕ ਸਮਰੱਥਾਵਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਵੀ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਉਹ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਬਚ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਹੇਟਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵਧ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਅਤੇ ਕਾਰਬਨ ਡਾਈਆਕਸਾਈਡ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਖੁਸ਼ਬੂਦਾਰ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੇ ਹਨ (1-3)। ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਊਰਜਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਰੌਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ੀ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਰਸਾਇਣਕ ਊਰਜਾ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਉਦੋਂ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜਦੋਂ ਲਾਈਟ-ਟਰੈਪਿੰਗ ਐਂਟੀਨਾ ਕੰਪਲੈਕਸ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਸੋਖ ਲੈਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਸੀ ਹੋਈ ਊਰਜਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੇਂਦਰ (RC) ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਚਾਰਜ ਵੱਖਰਾ ਹੋਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (4 - 7)। ਜਾਮਨੀ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮੂਲ ਇਕਾਈ ਟਾਈਪ 2 RC ਤੋਂ ਬਣੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਲਾਈਟ-ਹਾਰਵੈਸਟਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸ 1 (LH1) ਨਾਲ ਘਿਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ RC-LH1 ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ। LH1 ਵਕਰ αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਹਰ ਇੱਕ ਦੋ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਕਲੋਰੋਫਿਲ (BChl) ਅਣੂ ਅਤੇ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ (8-12) ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ। ਸਭ ਤੋਂ ਸਰਲ LH1 ਐਂਟੀਨਾ ਵਿੱਚ 16 ਜਾਂ 17 αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਇੱਕ ਬੰਦ ਲੂਪ ਵਿੱਚ RC (9-13) ਨੂੰ ਘੇਰਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਹੋਰ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ, ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਪੇਪਟਾਇਡ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ LH1 ਦੀ ਨਿਰੰਤਰਤਾ ਵਿੱਚ ਵਿਘਨ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ RC ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਕ੍ਰੋਮ bc1 ਕੰਪਲੈਕਸ (11, 13-15) ਵਿਚਕਾਰ ਕੁਇਨੋਲ/ਕੁਇਨੋਨ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਜਾਮਨੀ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਪੌਦਾ ਰੋਡੋਪਸੀਡੋਮੋਨਸ (Rps.) ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਜੀਵ ਹੈ ਜੋ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਊਰਜਾ ਅਤੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਨੂੰ ਸਮਝ ਸਕਦਾ ਹੈ। Rps ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਢਾਂਚਾ। ਪੈਲਸਟ੍ਰਿਸ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦਾ ਮਾਡਲ RC ਹੈ, ਜੋ ਕਿ 15 ਹੇਟਰੋਡਾਈਮੇਰਿਕ LH1 ਲੂਪਸ ਨਾਲ ਘਿਰਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ "ਪ੍ਰੋਟੀਨ W" (14) ਨਾਮਕ ਇੱਕ ਅਣਜਾਣ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਵਿਘਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ RPA4402 ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ, ਜੋ ਕਿ ਤਿੰਨ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਹੈਲੀਸ (TMH) (16) ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਅਣਪਛਾਤਾ 10.5kDa ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ। ਅਸੀਂ RPA4402 ਜੀਨ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਦਾ ਨਾਮ ਬਦਲ ਕੇ pufW ਕਰਨ ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵ ਰੱਖਦੇ ਹਾਂ ਤਾਂ ਜੋ RC-L, M (pufL, pufM) ਅਤੇ LH1α, β (pufA, pufB) ਸਬਯੂਨਿਟਾਂ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਨਾਮਕਰਨ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੋਵੇ। ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਸਿਰਫ RC-LH1 ਦੇ ਲਗਭਗ 10% ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੈ, ਜੋ Rps ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਪੈਲਸਟ੍ਰਿਸ ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਦੋ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਕ੍ਰਾਇਓ-EM (ਕ੍ਰਾਇਓ-EM) ਢਾਂਚੇ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਅਤੇ 14 αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਦੇ ਨਾਲ, ਦੂਜਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਅਤੇ ਇੱਕ ਬੰਦ 16 ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ LH1 ਲੂਪ। ਸਾਡੀ ਬਣਤਰ Rps. ਪੈਲਸਟ੍ਰਿਸ ਦੇ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਸਮਝ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕਦਮ ਤਬਦੀਲੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਅਸੀਂ ਹਰੇਕ ਵੇਰੀਐਂਟ ਦੀ ਸਮਰੂਪ ਆਬਾਦੀ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਹੈ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਪੇਪਟਾਇਡ ਅਤੇ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ ਰੰਗਾਂ ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਲਿਪਿਡਾਂ ਅਤੇ ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਨੂੰ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਹੈ। ਇਹਨਾਂ ਢਾਂਚਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਤਿੰਨ TMH ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਜੋ ਹੁਣ ਤੱਕ ਕਿਸੇ ਹੋਰ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਮਿਲੇ ਹਨ, ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕੁਇਨੋਨ ਚੈਨਲ ਤਿਆਰ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਕਈ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਕੁਇਨੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਸੀਂ ਕੁਇਨੋਨ ਅਤੇ RC ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਆਕਸੀਜਨ ਵਾਲੇ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਜੀਵਾਂ ਦੇ ਫੋਟੋਸਿਸਟਮ II (PSII) RC ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਾਡੀਆਂ ਖੋਜਾਂ ਜਾਮਨੀ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ RC-LH1 ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਐਕਸਚੇਂਜ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਨਵੀਂ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।
Rps. palustris ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਦੋ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਅਧਿਐਨ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਹਰੇਕ RC-LH1 ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ W-ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਕੰਪਲੈਕਸ (ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ΔpufW ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਨੂੰ pufW ਜੀਨ ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (16), ਅਤੇ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ W-ਰੱਖਣ ਵਾਲਾ ਕੰਪਲੈਕਸ ਇੱਕ ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਨੂੰ ਇਸਦੇ C-ਟਰਮੀਨਸ 'ਤੇ 10x His ਟੈਗ ਨਾਲ ਸੋਧਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W-ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਧਾਤ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਕੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਨਾਲ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕੇ। ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (16) ਐਫੀਨਿਟੀ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (IMAC)।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 1 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਦੋਵਾਂ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਤਿੰਨ ਸਬ-ਯੂਨਿਟ RC (RC-L, RC-M ਅਤੇ RC-H) ਹਨ ਜੋ ਇੱਕ LH1 ਐਂਟੀਨਾ ਨਾਲ ਘਿਰੇ ਹੋਏ ਹਨ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੀ ਘਾਟ ਵਾਲੇ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ 2.80-A ਬਣਤਰ 16 αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਦਿਖਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ RC ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਇੱਕ ਬੰਦ LH1 ਲੂਪ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W-ਯੁਕਤ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ 2.65Å ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ 14-ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ LH1 ਹੈ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੁਆਰਾ ਵਿਘਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ RC-LH114-W ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
(A ਅਤੇ B) ਮਿਸ਼ਰਣ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ। (C ਅਤੇ D) ਡੰਡਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ ਰੰਗਦਾਰ। (E ਅਤੇ F) ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮਿਕ ਸਤ੍ਹਾ ਤੋਂ ਦੇਖੇ ਗਏ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਕਾਰਟੂਨਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਪੇਪਟਾਇਡ ਅਤੇ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਹਨ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਪਾੜੇ ਤੋਂ ਘੜੀ ਦੀ ਦਿਸ਼ਾ ਵਿੱਚ ਨੰਬਰ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਹਨ [Rba ਨੰਬਰਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ। ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ ਕੰਪਲੈਕਸ (13)]। LH1-α ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਯੂਨਿਟ ਦਾ ਰੰਗ ਪੀਲਾ ਹੈ; LH1-β ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਯੂਨਿਟ ਦਾ ਰੰਗ ਨੀਲਾ ਹੈ; ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਲਈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਾਲ ਹੈ; RC-H ਲਈ, ਇਹ ਸਿਆਨ ਹੈ; RC-L ਲਈ, ਇਹ ਸੰਤਰੀ ਹੈ; RC-M ਲਈ, ਮੈਜੈਂਟਾ। ਕੋਫੈਕਟਰਾਂ ਨੂੰ ਡੰਡਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਹਰਾ BChl ਅਤੇ BPh a ਅਣੂਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਾਮਨੀ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਪੀਲਾ UQ10 ਅਣੂਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। (G ਅਤੇ H) RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ (G) ਅਤੇ RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ (H) ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਪਾੜੇ ਦਾ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਦ੍ਰਿਸ਼। ਕੋਫੈਕਟਰ ਸਪੇਸ ਫਿਲਿੰਗ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਚੇਲੇਟਿਡ ਕੁਇਨੋਨ ਨੀਲੇ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਡਬਲਯੂ ਪਾੜੇ ਨੂੰ (G) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨੀਲੀ ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ ਦੁਆਰਾ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਛੇਕ ਜਿੱਥੇ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਲ LH116 ਰਿੰਗ 'ਤੇ ਫੈਲਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ (H) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਕਾਲੀ ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ ਦੁਆਰਾ ਉਜਾਗਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਚਿੱਤਰ 1 (A ਅਤੇ B) LH1αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਖੁੱਲ੍ਹੇ ਜਾਂ ਬੰਦ ਐਰੇ ਨਾਲ ਘਿਰਿਆ RC ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਹਰ ਇੱਕ ਦੋ BChl ਅਤੇ ਇੱਕ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1, C ਅਤੇ D)। ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ Rps LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਹੈ। ਸਪੀਰੂਲੀਨਾ ਜ਼ੈਂਥਿਨ ਦੇ ਬਾਇਓਸਿੰਥੈਟਿਕ ਮਾਰਗ ਵਿੱਚ, ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡਜ਼ ਦੀ ਮਿਸ਼ਰਤ ਆਬਾਦੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ (17)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਪਾਈਰੋਪਾਈਰੋਕਸੈਂਥਿਨ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਘਣਤਾ ਤਸੱਲੀਬਖਸ਼ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਰੇ LH1 ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ 'ਤੇ ਸਪਾਈਰੋਕਸੈਂਥਿਨ ਨੂੰ ਮਾਡਲ ਕਰਨ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ। ਅਲਫ਼ਾ ਅਤੇ ਬੀਟਾ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਛੋਟੇ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਬਾਹਰੀ ਖੇਤਰਾਂ ਵਾਲੇ ਸਿੰਗਲ TMH ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1, A, B, E, ਅਤੇ F)। ਹਾਲਾਂਕਿ C-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ 17 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਘਣਤਾ ਨਹੀਂ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ, ਪਰ ਅਲਫ਼ਾ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਦੋਵਾਂ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ Met1 ਤੋਂ Ala46 ਤੱਕ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। RC-LH116 ਵਿੱਚ β ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਨੂੰ Gly4 ਤੋਂ Tyr52 ਤੱਕ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ RC-LH114-W ਵਿੱਚ Ser5 ਤੋਂ Tyr52 ਤੱਕ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 3 ਜਾਂ 4 N-ਟਰਮੀਨਲ ਜਾਂ 13 C-ਟਰਮੀਨਲ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਘਣਤਾ ਨਹੀਂ ਦੇਖੀ ਗਈ (ਚਿੱਤਰ S1)। ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਿਸ਼ਰਤ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਗੁੰਮ ਹੋਇਆ ਖੇਤਰ ਇਹਨਾਂ ਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਦੇ ਹੇਟਰੋਲੋਗਸ ਕਲੀਵੇਜ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ S1 ਅਤੇ S2)। α-Met1 ਦਾ N-ਟਰਮੀਨਲ ਫਾਰਮਾਈਲੇਸ਼ਨ ਵੀ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ (f)। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ α-ਪੇਪਟਾਈਡ ਵਿੱਚ fMet1 ਤੋਂ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ਤੱਕ ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ β-ਪੇਪਟਾਈਡ ਵਿੱਚ Ser2 ਤੋਂ Ala53 ਤੱਕ ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਘੱਟ-ਤਾਪਮਾਨ EM ਘਣਤਾ ਨਕਸ਼ੇ ਨਾਲ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸਹਿਮਤ ਹੈ।
α-His29 ਅਤੇ β-His36 ਦਾ ਤਾਲਮੇਲ BChls ਨੂੰ ਆਹਮੋ-ਸਾਹਮਣੇ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ; ਹਰੇਕ αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਆਪਣੇ ਗੁਆਂਢੀਆਂ ਨਾਲ ਇਕੱਠਾ ਹੋ ਕੇ RC ਦੇ ਆਲੇ-ਦੁਆਲੇ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਲੂਪ (RC-LH114-W) ਜਾਂ ਇੱਕ ਬੰਦ ਲੂਪ (RC-LH116) ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਐਕਸਾਈਟਨ ਕਪਲਡ ਪਿਗਮੈਂਟ ਐਰੇ (ਚਿੱਤਰ 1, C ਅਤੇ D)। RC-LH114-W ਦੇ 877 nm ਬੈਂਡ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, RC-LH116 ਦਾ 880 nm ਸੋਖਣ ਲਾਲ ਸ਼ਿਫਟ 3 nm (ਚਿੱਤਰ 2A) ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਗੋਲਾਕਾਰ ਡਾਇਕ੍ਰੋਇਜ਼ਮ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਲਗਭਗ ਇੱਕੋ ਜਿਹਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2B), ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹਾਲਾਂਕਿ ਖੁੱਲ੍ਹੇ ਅਤੇ ਬੰਦ ਲੂਪਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਪੱਸ਼ਟ ਅੰਤਰ ਹੈ, BChls ਦਾ ਸਥਾਨਕ ਵਾਤਾਵਰਣ ਬਹੁਤ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਸੋਖਣ ਲਾਲ ਸ਼ਿਫਟ ਘਟੀ ਹੋਈ ਥਰਮਲ ਗਤੀ ਅਤੇ ਬੰਦ ਲੂਪ 'ਤੇ ਵਧੀ ਹੋਈ ਸਥਿਰਤਾ (18, 19), ਬੰਦ ਲੂਪ (20, 21) ਕਾਰਨ ਪਿਗਮੈਂਟ ਕਪਲਿੰਗ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ, ਜਾਂ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ (11)।
(ਏ) ਅਲਟਰਾਵਾਇਲਟ/ਦਿੱਖਣਯੋਗ/ਨੇੜਲਾ-ਇਨਫਰਾਰੈੱਡ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ, ਜਿਸਦੀਆਂ ਸਿਖਰਾਂ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਰੰਗਾਂ ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 775 nm 'ਤੇ BPh ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (ਬੀ) 805 nm 'ਤੇ BChl ਸੋਖਣ ਲਈ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (ਸੀ ਅਤੇ ਡੀ) RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ (C) ਅਤੇ RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ (D) ਦੇ ਸਮਾਂ-ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ ਤੋਂ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ΔA ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ। ਬਿਹਤਰ ਤੁਲਨਾ ਲਈ, ਸਾਰੇ ਸਪੈਕਟ੍ਰਾ ਨੂੰ 0.2 ps 'ਤੇ ∆A ਦੇ ∆A ਵਿੱਚ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (ਈ) UQ2 ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਕਿਰਨੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਾਈਟੋਕ੍ਰੋਮ c2 ਆਕਸੀਕਰਨ ਦੀ ਦਰ (ਕੱਚੇ ਡੇਟਾ ਲਈ ਚਿੱਤਰ S8 ਵੇਖੋ)। (ਐਫ) ਘੱਟ, ਦਰਮਿਆਨੀ ਜਾਂ ਉੱਚ ਤੀਬਰਤਾ ਵਾਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ 10, 30 ਜਾਂ 300μMm-2 s-1) ਦੇ ਅਧੀਨ ਵਧੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਅਤੇ RC-L ਸ਼ੁੱਧ ਕੰਪਲੈਕਸ ਅਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਝਿੱਲੀ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਉਪ-ਯੂਨਿਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। SDS-ਪੋਲੀਐਕਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਅਤੇ ਇਮਯੂਨੋਐਸੇ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੱਧਰ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ (ਕੱਚੇ ਡੇਟਾ ਲਈ ਚਿੱਤਰ S9 ਵੇਖੋ)। ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤੇ RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਅਨੁਪਾਤ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ। ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਲਈ RC-L ਦਾ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟ੍ਰਿਕ ਅਨੁਪਾਤ 1:1 ਹੈ।
RC-LH114-W (ਚਿੱਤਰ 1, A, C, ਅਤੇ E) ਦੇ ਵਿਗੜੇ ਹੋਏ αβ14 ਲੂਪ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ 1 'ਤੇ BChls, RC-LH116 (ਚਿੱਤਰ 1, B, D, ਅਤੇ F, ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S3) ਵਿੱਚ ਬਰਾਬਰ BChls ਨਾਲੋਂ RC ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਡੋਨਰ (P) ਦੇ 6.8Å ਨੇੜੇ ਹਨ; ਹਾਲਾਂਕਿ, ਦੋਨਾਂ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਅਸਥਾਈ ਸਮਾਈ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ RC-LH114-W ਅਤੇ RC-LH116 ਲਈ, LH1 ਤੋਂ RC ਤੱਕ ਉਤਸਾਹ ਊਰਜਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਸਮਾਂ ਸਥਿਰਾਂਕ 40 ±4 ਅਤੇ 44±3 ps ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 2)। , C ਅਤੇ D, ਚਿੱਤਰ S4 ਅਤੇ ਸਾਰਣੀ S2)। RC ਦੇ ਅੰਦਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਵਿੱਚ ਵੀ ਕੋਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S5 ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪੂਰਕ ਟੈਕਸਟ)। ਸਾਨੂੰ ਸ਼ੱਕ ਹੈ ਕਿ LH1 ਅਤੇ RC-P ਵਿਚਕਾਰ ਊਰਜਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਸਮੇਂ ਦਾ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਪੱਤਰ ਵਿਹਾਰ ਦੋ LH1 ਲੂਪਾਂ ਵਿੱਚ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ BChl ਦੀ ਸਮਾਨ ਦੂਰੀ, ਕੋਣ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ ਊਰਜਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੈ। ਅਜਿਹਾ ਲਗਦਾ ਹੈ ਕਿ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਦੂਰੀ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਲਈ LH1 ਊਰਜਾ ਪੈਟਰਨ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨਾ ਸਬਓਪਟੀਮਮਲ ਸਾਈਟਾਂ ਤੋਂ RC ਤੱਕ ਸਿੱਧੇ ਊਰਜਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ ਨਹੀਂ ਹੈ। RC-LH114-W ਵਿੱਚ ਓਪਨ-ਲੂਪ LH1 ਲੂਪ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਮਾਮੂਲੀ ਥਰਮਲ ਗਤੀ ਵਿੱਚੋਂ ਗੁਜ਼ਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ RC 1 ਦੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ βBChls ਦੇ ਪਿਗਮੈਂਟੇਸ਼ਨ ਦੂਰੀ ਤੋਂ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਇੱਕ ਲੰਮਾ αβ14 ਰਿੰਗ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ 32 BChls ਅਤੇ 16 ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਸਮੁੱਚਾ ਪ੍ਰਬੰਧ ਥਰਮੋਕ੍ਰੋਮੇਟੀਅਮ (Tch.) ਪਿਡਪਿਡਮ [ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਡੇਟਾ ਬੈਂਕ (PDB) ID 5Y5S] (9), ਥਿਓਰਹੋਡੋਵਿਬ੍ਰਿਓ (Trv.) 970 ਸਟ੍ਰੇਨ (PDB ID 7C9R) (12) ਅਤੇ ਹਰਾ ਐਲਗੀ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰਾਂ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਛੋਟੇ ਭਟਕਾਅ ਦੇਖੇ ਗਏ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ 1-5, 15, ਅਤੇ 16 (ਚਿੱਤਰ S6)। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ LH1 ਦੀ ਬਣਤਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਂਦਾ ਹੈ। ਇਸਦੇ ਤਿੰਨ TMH ਛੋਟੇ ਲੂਪਾਂ ਦੁਆਰਾ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਹਨ, ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਲੂਮੇਨ ਪਾਸੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਅਤੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਪਾਸੇ C-ਟਰਮੀਨਲ (ਚਿੱਤਰ 1A ਅਤੇ 3, A ਤੋਂ D)। ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3B), ਅਤੇ TMH2 ਅਤੇ TMH3 LH1αβ-14 ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਸਤਹ ਬਣਾਈ ਜਾ ਸਕੇ (ਚਿੱਤਰ 3, B ਅਤੇ E ਤੋਂ G)। ਇੰਟਰਫੇਸ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਮੇਂਬ੍ਰੇਨ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ Phe, Leu ਅਤੇ Val ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਅਤੇ αβ-14 ਰੰਗਾਂ ਨਾਲ ਭਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਕੁਝ ਧਰੁਵੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਵੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਗੁਫਾ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ W-Thr68 ਅਤੇ β-Trp42 ਵਿਚਕਾਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬੰਧਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3, F ਅਤੇ G)। ਸਾਇਟੋਪਲਾਜ਼ਮ ਦੀ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ, Gln34 αβ-14 ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡਜ਼ ਦੇ ਕੀਟੋ ਸਮੂਹ ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ਅਣੂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਪੂਛ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਅਤੇ αβ-14 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੰਟਰਫੇਸ ਤੱਕ ਫੈਲ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਲਿਪਿਡ ਪੂਛ ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਇਹ ਵੀ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਅਤੇ RCH ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਖੇਤਰ ਬਹੁਤ ਨੇੜੇ ਹਨ, ਪਰ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਬਣਾਉਣ ਦੇ ਦਾਇਰੇ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1, A ਅਤੇ E)। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ ਅਣਸੁਲਝੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡਾਂ ਵਿੱਚ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਅਸੈਂਬਲੀ ਦੌਰਾਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੀ ਭਰਤੀ ਲਈ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।
(A) ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W, ਜੋ ਕਾਰਟੂਨ ਰੂਪ ਵਿੱਚ LH1αβ14 ਦੇ ਇੰਟਰਫੇਸ ਦਾ ਸਾਹਮਣਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਡੰਡੇ ਦੇ ਆਕਾਰ ਦੀ ਸਾਈਡ ਚੇਨ (ਲਾਲ) ਹੈ, ਜੋ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਟੈਟਿਕ ਸੰਭਾਵੀ ਚਿੱਤਰ ਦੇ ਇੱਕ ਹਿੱਸੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ (0.13 ਦੇ ਕੰਟੋਰ ਪੱਧਰ ਦੇ ਨਾਲ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਸਲੇਟੀ ਸਤਹ)। (B) ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਰੰਗੀਨ ਸਤਹ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਈ ਗਈ ਹੈ। ਧਰੁਵੀ ਅਤੇ ਚਾਰਜ ਕੀਤੇ ਖੇਤਰ ਸਿਆਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਖੇਤਰ ਚਿੱਟੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਖੇਤਰ ਸੰਤਰੀ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। (C ਅਤੇ D) ਕਾਰਟੂਨ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਈ ਗਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W, ਇਸਦੀ ਸਥਿਤੀ (A) (C) ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਅਤੇ 180° (D) ਦੁਆਰਾ ਘੁੰਮਾਈ ਗਈ ਹੈ। ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਵੱਖ ਕਰਨ ਯੋਗ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਇੱਕ ਸਤਰੰਗੀ ਰੰਗ ਸਕੀਮ ਅਪਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿੱਥੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਨੀਲਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਲਾਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। (E) ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W (A) ਦੇ ਸਮਾਨ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਵਿੱਚ, ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W:LH1 ਦੇ ਇੰਟਰਫੇਸ 'ਤੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਨਿਸ਼ਾਨਾਂ ਨਾਲ ਡੰਡੇ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। (F) ਕਾਰਟੂਨ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਨੂੰ (E) ਅਤੇ LH1αβ14 ਦੇ ਸਾਪੇਖਕ 90° ਘੁੰਮਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਾਰ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰਫੇਸ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਸਾਪੇਖਕ। ਬੀਟਾ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਤੋਂ ਓਵਰਹੈਂਗਿੰਗ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਕੋਫੈਕਟਰ ਨੂੰ ਚਿੱਤਰ 1 ਦੇ ਰੰਗ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਇੱਕ ਬਾਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਸੜਿਆ ਹੋਇਆ β-DDM ਸਲੇਟੀ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਆਕਸੀਜਨ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। (G) (F) ਵਿੱਚ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਨੂੰ 180° ਘੁੰਮਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਅਲਫ਼ਾ ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਨਾਲ।
ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਡਬਲਯੂ ਇੱਕ αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ (ਚਿੱਤਰ 1F ਵਿੱਚ 15ਵਾਂ) ਦੀ ਥਾਂ ਲੈਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਲੂਪ ਬੰਦ ਹੋਣ ਤੋਂ ਰੋਕਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪਹਿਲੇ ਤਿੰਨ αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਝੁਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਕਿ ਫਿਲਮ ਨਾਰਮਲ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਪਹਿਲੇ αβ-1 ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਦਾ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਝੁਕਾਅ ਕੋਣ 25° ਤੋਂ 29° (ਚਿੱਤਰ 1, A ਅਤੇ E) ਸੀ, ਜੋ ਕਿ RC A ਤਿੱਖੇ ਕੰਟ੍ਰਾਸਟ-LH116 (ਚਿੱਤਰ 1, B ਅਤੇ F) ਵਿੱਚ αβ-1 ਦੇ 2° ਤੋਂ 8° ਝੁਕਾਅ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੂਜੇ ਅਤੇ ਤੀਜੇ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 12° ਤੋਂ 22° ਅਤੇ 5° ਤੋਂ 10° 'ਤੇ ਝੁਕੇ ਹੋਏ ਹਨ। RC ਦੇ ਸਟੀਰਿਕ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਕਾਰਨ, αβ-1 ਦੇ ਝੁਕਾਅ ਵਿੱਚ αβ ਦਾ ਦੂਜਾ ਜੋੜਾ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ (ਜੋ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 1F ਵਿੱਚ 16ਵੇਂ αβ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ), ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ LH1 ਰਿੰਗ (ਚਿੱਤਰ 1, A ਅਤੇ E) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਪੱਸ਼ਟ ਪਾੜਾ ਬਣਦਾ ਹੈ। ਦੋ αβ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਚਾਰ BChl ਅਤੇ ਦੋ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡਾਂ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਦੇ ਨਾਲ, ਕੋਈ ਵੀ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਮਰੋੜੇ ਹੋਏ αβ-1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਜੁੜਦਾ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ LH114-W ਰਿੰਗ ਬਣਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 13 ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਸ਼ਾਕਾਹਾਰੀ ਅਤੇ 28 BChl ਹੁੰਦੇ ਹਨ। αβ1 ਤੋਂ 7 ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੋ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੇ ਸਥਾਨਕ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਅਨੁਮਾਨ ਬਾਕੀ LH1 ਲੂਪ ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ RC QB ਸਾਈਟ (ਚਿੱਤਰ 4) ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਦੀ ਅੰਦਰੂਨੀ ਪਲਾਸਟਿਕਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
RC-LH114-W (A ਅਤੇ B) ਅਤੇ RC-LH116 (C ਅਤੇ D) ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਚਿੱਤਰ 1. (B ਅਤੇ D) ਦੇ ਇੱਕੋ ਹੀ ਉੱਪਰਲੇ ਦ੍ਰਿਸ਼/ਪਾਸੇ ਦੇ ਦ੍ਰਿਸ਼ (A ਅਤੇ B) (A ਅਤੇ C) ਅਤੇ ਗੁਫਾ ਸਤਹ ਤੋਂ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। ਰੰਗੀਨ ਕੁੰਜੀਆਂ ਸੱਜੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।
1:14 ਦੇ ਸਟੋਈਚਿਓਮੈਟ੍ਰਿਕ ਅਨੁਪਾਤ ਵਾਲਾ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਹੋਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਾਲਾ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਰੋਡੋਕੋਕਸ ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ (Rba.) RC-LH1-PufX ਡਾਈਮਰ (13) ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਅਤੇ PufX ਦਾ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸਮਰੂਪਤਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ LH1 ਢਾਂਚਿਆਂ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੈ। PufX ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ TMH ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ N-ਟਰਮੀਨਲ ਸਾਇਟੋਪਲਾਸਮਿਕ ਡੋਮੇਨ ਹੈ ਜੋ Rps. palustris LH116αβ-16 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ RC-H ਸਬਯੂਨਿਟ (13) ਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਸਮਿਕ ਪਾਸੇ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦਾ ਹੈ। PufX RC-LH1 ਅਤੇ ਸਾਈਟੋਕ੍ਰੋਮ bcl ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿਚਕਾਰ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਲਈ ਇੱਕ ਚੈਨਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਾਰੇ Rba. sphaeroides ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ (13) ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਮੋਨੋਮਰ-ਮੋਨੋਮਰ ਇੰਟਰਫੇਸ Rba ਵਿੱਚ ਹੈ। ਸਫੈਰੋਇਡਜ਼ RC-LH1-PufX ਡਾਈਮਰ RC-LH114-W ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਅਤੇ PufX ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪਾੜਾ ਇੱਕ ਬਰਾਬਰ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S7A)। RC-LH114-W ਵਿੱਚ ਪਾੜਾ ਸੂਡੋਮੋਨਾਸ ਰੋਜ਼ਾ LH1 ਦੇ ਕਾਲਪਨਿਕ ਕੁਇਨੋਨ ਚੈਨਲ (8) ਨਾਲ ਵੀ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਜਾਂ PufX (ਚਿੱਤਰ S7B) ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਨਾ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, Blc ਵਿੱਚ ਕੁਇਨੋਨ ਚੈਨਲ। ਇੱਕ γ ਸਬਯੂਨਿਟ (7) ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਐਮਰਾਲਡ ਹਰਾ LH1 ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਸਥਿਤੀ (ਚਿੱਤਰ S7C) ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਾਂਝੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਲ ਚੈਨਲਾਂ ਦੀ ਦਿੱਖ ਕਨਵਰਜੈਂਟ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਜਾਪਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਪਾੜਾ ਇੱਕ ਕੁਇਨੋਨ ਚੈਨਲ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
LH114-W ਲੂਪ ਵਿੱਚ ਪਾੜਾ RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸਪੇਸ ਅਤੇ ਬਲਕ ਝਿੱਲੀ (ਚਿੱਤਰ 1G) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਨਿਰੰਤਰ ਝਿੱਲੀ ਖੇਤਰ ਦੇ ਗਠਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਨਾ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਾਂਗ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੋਰ ਰਾਹੀਂ ਦੋ ਡੋਮੇਨਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਬਜਾਏ। RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਇੱਕ ਬੰਦ Tch. ਸੂਈ-ਵਰਗੇ ਕੰਪਲੈਕਸ (22) (ਚਿੱਤਰ 1H) ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਕਿਉਂਕਿ ਝਿੱਲੀ ਰਾਹੀਂ ਕੁਇਨੋਨ ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰ ਤੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਚੈਨਲ ਰਾਹੀਂ ਫੈਲਣ ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਖੁੱਲ੍ਹਾ LH114-W ਲੂਪ ਬੰਦ LH116 ਲੂਪ ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ RC ਟਰਨਓਵਰ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ RC ਵਿੱਚ ਕੁਇਨੋਨ ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰ ਵਧੇਰੇ ਸੀਮਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ W RC ਰਾਹੀਂ ਕੁਇਨੋਨ ਦੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ubiquinone 2 (UQ2) (ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਆਈਸੋਪ੍ਰੀਨ ਪੂਛ ਦੇ ਨਾਲ ਕੁਦਰਤੀ UQ10 ਦਾ ਇੱਕ ਐਨਾਲਾਗ) (ਚਿੱਤਰ 2E) ਦੀ ਇੱਕ ਖਾਸ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਇੱਕ ਸਾਇਟੋਕ੍ਰੋਮ ਆਕਸੀਕਰਨ ਪਰਖ ਕੀਤੀ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਚੇਲੇਟਿਡ ਕੁਇਨੋਨ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਮਾਈਕਲਿਸ ਸਥਿਰਾਂਕ (RC-LH114-W ਅਤੇ RC-LH116 ਕ੍ਰਮਵਾਰ 0.2±0.1μM ਅਤੇ 0.5±0.2μM ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਹਨ) ਦੇ ਸਹੀ ਨਿਰਧਾਰਨ ਵਿੱਚ ਰੁਕਾਵਟ ਪਾਉਂਦੀ ਹੈ, RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ਦੀ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਦਰ RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) ਨਾਲੋਂ 28±5% ਵੱਡੀ ਹੈ।
ਅਸੀਂ ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਸੀ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਲਗਭਗ 10% ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੈ (16); ਇੱਥੇ, ਘੱਟ-ਰੋਸ਼ਨੀ, ਦਰਮਿਆਨੀ-ਰੋਸ਼ਨੀ, ਅਤੇ ਉੱਚ-ਰੋਸ਼ਨੀ ਵਿਕਾਸ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਆਕੂਪੈਂਸੀ ਦਰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 15±0.6%, 11±1% ਅਤੇ 0.9±0.5 ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 2F)। ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤੁਲਨਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਟੈਗ ਦੇ ਜੋੜ ਨੇ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸਟ੍ਰੇਨ (P = 0.59) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਭਰਪੂਰਤਾ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਘਟਾਇਆ, ਇਸ ਲਈ ਇਹ ਪੱਧਰ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W (ਚਿੱਤਰ S10) ਦਾ ਇੱਕ ਕਲਾਤਮਕ ਨਹੀਂ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦੀ ਇਹ ਘੱਟ ਆਕੂਪੈਂਸੀ ਕੁਝ RCs ਨੂੰ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਦਰ 'ਤੇ ਫਲਿੱਪ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦੇ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਹੌਲੀ ਕੁਇਨੋਨ/ਕੁਇਨੋਲੋਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ ਕਿ ਉੱਚ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੀ ਕਿਰਿਆ ਦਰ ਹਾਲੀਆ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਅਸੰਗਤ ਹੈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਤੇਜ਼ ਰੋਸ਼ਨੀ (ਚਿੱਤਰ S11) (23) ਦੇ ਅਧੀਨ pufW ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। pufW ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਉਲਝਣ ਵਾਲਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਨਿਯਮ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
RC-LH114-W ਵਿੱਚ, 6 ਕਾਰਡੀਓਲਿਪਿਨ (CDL), 7 ਫਾਸਫੇਟਿਡਿਲਕੋਲੀਨ (POPC), 1 ਫਾਸਫੇਟਿਡਿਲਗਲਿਸਰੋਲ (POPG) ਅਤੇ 29 β-DDM ਅਣੂ ਇਸ ਵਿੱਚ 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs ਅਤੇ 12 βDDMs ਨਿਰਧਾਰਤ ਅਤੇ ਮਾਡਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। RC-LH116 (ਚਿੱਤਰ 5, A ਅਤੇ B)। ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਢਾਂਚਿਆਂ ਵਿੱਚ, CDL ਲਗਭਗ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਸਾਇਟੋਪਲਾਸਮਿਕ ਪਾਸੇ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ POPC, POPG ਅਤੇ β-DDM ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਲੂਮਿਨਲ ਪਾਸੇ ਸਥਿਤ ਹਨ। RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ (ਚਿੱਤਰ 5A) ਦੇ αβ-1 ਤੋਂ αβ-6 ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਡਿਟਰਜੈਂਟ ਅਣੂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਪੰਜ RC-LH116 (ਚਿੱਤਰ 5B) ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਦੂਜੇ ਪਾਸੇ ਹੋਰ ਲਿਪਿਡ ਪਾਏ ਗਏ, ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ CDL, ਜੋ RC ਅਤੇ αβ-7 ਤੋਂ αβ-13 (ਚਿੱਤਰ 5, A ਅਤੇ B) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇਕੱਠੇ ਹੋਏ ਸਨ। ਹੋਰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਡਿਟਰਜੈਂਟ LH1 ਰਿੰਗ ਦੇ ਬਾਹਰ ਸਥਿਤ ਹਨ, ਅਤੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਐਸੀਲ ਚੇਨ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਫੈਲਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ RC-LH114-W ਵਿੱਚ β-DDM ਵਜੋਂ ਅਸਥਾਈ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਨੋਨੀਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਅਤੇ RC ਵਿੱਚ β-DDM ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। β-DDM ਅਤੇ POPC-LH116 ਦਾ ਮਿਸ਼ਰਣ। ਸਾਡੀ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਚੇਲੇਟਿੰਗ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਡਿਟਰਜੈਂਟ ਦੀਆਂ ਸਮਾਨ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ ਉਹ ਸਰੀਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ S12A)। Tch ਵਿੱਚ ਬਰਾਬਰ ਅਣੂਆਂ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੀ ਚੰਗੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਹੈ। ਕੋਮਲ ਅਤੇ Trv. ਸਟ੍ਰੇਨ 970 RC-LH1s (ਚਿੱਤਰ S12, B ਤੋਂ E) (9, 12) ਅਤੇ ਲਿਪਿਡ ਹੈੱਡ ਗਰੁੱਪ ਦੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ-ਬੰਧਨ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੇ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ (ਚਿੱਤਰ S13) ਵਿੱਚ ਕਾਫ਼ੀ ਵਧੀਆ ਸੰਭਾਲ ਦਿਖਾਈ, ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੰਭਾਲਿਆ ਹੋਇਆ CDL ਜੋ RC (24) ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਇਹਨਾਂ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਲਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
(A ਅਤੇ B) RC-LH114-W (A) ਅਤੇ RC-LH116 (B) ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਕਾਰਟੂਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਰੰਗਾਂ ਨੂੰ ਡੰਡਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਚਿੱਤਰ 1 ਵਿੱਚ ਰੰਗ ਸਕੀਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ। ਲਿਪਿਡ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ, ਅਤੇ ਡਿਟਰਜੈਂਟ ਸਲੇਟੀ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। RC QA ਅਤੇ QB ਸਾਈਟਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ UQ ਪੀਲਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ UQ ਨੀਲਾ ਹੈ। (C ਅਤੇ D) (A) ਅਤੇ (B) ਦੇ ਸਮਾਨ ਦ੍ਰਿਸ਼, ਲਿਪਿਡਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ। (E ਤੋਂ G) RC-LH116 ਤੋਂ Q1(E), Q2(F) ਅਤੇ Q3(G) ਦਾ ਵੱਡਾ ਦ੍ਰਿਸ਼, ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਸਾਈਡ ਚੇਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ। ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਕਾਲੀਆਂ ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨਾਂ ਵਜੋਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
RC-LH116 ਵਿੱਚ, RC QA ਅਤੇ QB UQ ਦੋਵੇਂ, ਜੋ ਚਾਰਜ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਵਿੱਚ ਹਿੱਸਾ ਲੈਂਦੇ ਹਨ, ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਕੰਪੋਜ਼ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, RC-LH114-W ਵਿੱਚ, QB ਕੁਇਨੋਨ ਨੂੰ ਹੱਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਚਰਚਾ ਕੀਤੀ ਜਾਵੇਗੀ। QA ਅਤੇ QB ਕੁਇਨੋਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਦੋ ਚੇਲੇਟਿਡ UQ ਅਣੂ (RC ਅਤੇ LH1 ਰਿੰਗਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਥਿਤ) RC-LH114-W ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਸਿਰ ਸਮੂਹਾਂ (ਕ੍ਰਮਵਾਰ Q1 ਅਤੇ Q2 ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ) ਸਪੇਸ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਚਿੱਤਰ 5C)। ਦੋ ਆਈਸੋਪ੍ਰੀਨ ਇਕਾਈਆਂ Q1 ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਘਣਤਾ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ Q2 ਦੀਆਂ ਪੂਰੀਆਂ 10 ਆਈਸੋਪ੍ਰੀਨ ਪੂਛਾਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਦਾ ਹੈ। RC-LH116 ਦੀ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ, ਤਿੰਨ ਚੇਲੇਟਿਡ UQ10 ਅਣੂ (Q1 ਤੋਂ Q3, ਚਿੱਤਰ 5D) ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਪੂਛ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਪਸ਼ਟ ਘਣਤਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5, D ਤੋਂ G)। ਦੋਨਾਂ ਢਾਂਚਿਆਂ ਵਿੱਚ, Q1 ਅਤੇ Q2 ਦੇ ਕੁਇਨੋਨ ਹੈੱਡ ਗਰੁੱਪਾਂ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਇਕਸਾਰਤਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ S12F), ਅਤੇ ਉਹ ਸਿਰਫ਼ RC ਨਾਲ ਹੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦੇ ਹਨ। Q1 RC-LH114-W (ਚਿੱਤਰ 1G ਅਤੇ 5, C, D ਅਤੇ E) ਦੇ W ਪਾੜੇ ਦੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੁਆਰ 'ਤੇ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਅਤੇ Q2 QB ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ (ਚਿੱਤਰ 5, C, D) ਅਤੇ F ਦੇ ਨੇੜੇ ਸਥਿਤ ਹੈ। ਸੁਰੱਖਿਅਤ L-Trp143 ਅਤੇ L-Trp269 ਅਵਸ਼ੇਸ਼ Q1 ਅਤੇ Q2 ਦੇ ਬਹੁਤ ਨੇੜੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ π-ਸਟੈਕਿੰਗ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 5, E ਅਤੇ F, ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ S12)। Q1 ਦੇ ਦੂਰੀ ਵਾਲੇ ਆਕਸੀਜਨ ਤੋਂ L-Gln88, 3.0 Å, ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5E); ਇਹ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਸਭ ਤੋਂ ਦੂਰ ਦੇ ਸਬੰਧ (ਚਿੱਤਰ S13) ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਸਾਰੇ RC ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ। L-Ser91 ਨੂੰ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਹੋਰ RCs (ਚਿੱਤਰ S13) ਵਿੱਚ Thr ਲਈ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, Q1 ਦੇ ਮਿਥਾਈਲ ਆਕਸੀਜਨ ਤੋਂ 3.8 ਐਂਗਸਟ੍ਰੋਮ ਹੈ, ਅਤੇ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5E)। Q3 ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਜਾਪਦਾ, ਪਰ ਇਹ RC-M ਸਬਯੂਨਿਟ ਅਤੇ LH1-α ਸਬਯੂਨਿਟ 5 ਤੋਂ 6 (ਚਿੱਤਰ 5, D ਅਤੇ G) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਫੋਬਿਕ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ। Q1, Q2 ਅਤੇ Q3 ਜਾਂ ਨੇੜਲੇ ਚੇਲੇਟਿਡ ਕੁਇਨੋਨ ਵੀ Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ਅਤੇ Blc ਵਿੱਚ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਆਇਰਿਸ ਬਣਤਰ (9, 10, 12) RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ (ਚਿੱਤਰ S12G) ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸਹਾਇਕ ਕੁਇਨੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕਰਦੀ ਹੈ। RC-LH116 ਵਿੱਚ ਪੰਜ ਸੜਨ ਵਾਲੇ UQs ਉੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਤਰਲ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (HPLC) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਹਰੇਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ 5.8±0.7 ਨਾਲ ਚੰਗੇ ਸਮਝੌਤੇ ਵਿੱਚ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ RC-LH114-W ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸੜਨ ਵਾਲੇ UQs 6.2±0.3 (ਚਿੱਤਰ S14) ਦੇ ਮਾਪੇ ਗਏ ਮੁੱਲ ਤੋਂ ਘੱਟ ਹਨ ਜੋ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਅਣਸੁਲਝੇ UQ ਅਣੂ ਹਨ।
ਸੂਡੋ-ਸਿਮਟ੍ਰਿਕ L ਅਤੇ M ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚ ਹਰੇਕ ਵਿੱਚ ਪੰਜ TMH ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ਇੱਕ BChl ਡਾਈਮਰ, ਦੋ BChl ਮੋਨੋਮਰ, ਦੋ ਬੈਕਟੀਰੀਓਫੇਜ (BPh) ਮੋਨੋਮਰ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਹੀਮ ਆਇਰਨ ਅਤੇ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ UQ10 ਅਣੂਆਂ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ। ਟਰਮੀਨਲ ਕੀਟੋਨ ਸਮੂਹ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਅਤੇ Rps ਵਿੱਚ ਇਸਦੇ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਸੰਚਵ ਦੁਆਰਾ, ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡਜ਼ ਨੂੰ M-ਸਬਯੂਨਿਟ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ cis-3,4-dehydroorhodopin ਨਾਮ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ (25)। RC-H ਦਾ ਬਾਹਰੀ ਝਿੱਲੀ ਡੋਮੇਨ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ TMH ਦੁਆਰਾ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਸਮੁੱਚੀ RC ਬਣਤਰ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ Rba) ਦੇ ਤਿੰਨ ਸਬਯੂਨਿਟ RC ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ (PDB ID: 3I4D)। BChl ਅਤੇ BPh ਦੇ ਮੈਕਰੋਸਾਈਕਲ, ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਬੈਕਬੋਨ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਹੀਮ ਆਇਰਨ ਇਹਨਾਂ ਢਾਂਚਿਆਂ ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਰੇਂਜ ਦੇ ਅੰਦਰ ਓਵਰਲੈਪ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ QA ਸਾਈਟ 'ਤੇ UQ10 ਹੈੱਡ ਗਰੁੱਪ ਅਤੇ RC-LH116 (ਚਿੱਤਰ S15) 'ਤੇ QB ਕੁਇਨੋਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਵੱਖ-ਵੱਖ QB ਸਾਈਟ ਆਕੂਪੈਂਸੀ ਦਰਾਂ ਵਾਲੇ ਦੋ RC ਢਾਂਚਿਆਂ ਦੀ ਉਪਲਬਧਤਾ QB ਕੁਇਨੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਮੌਕਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ। RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ, QB ਕੁਇਨੋਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬੰਨ੍ਹੀ ਹੋਈ "ਨੇੜਲੀ" ਸਥਿਤੀ (26) ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ, ਪਰ RC-LH114-W ਦੇ ਵੱਖ ਹੋਣ ਨਾਲ QB ਕੁਇਨੋਨ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ। RC-LH114-W ਵਿੱਚ ਕੋਈ QB ਕੁਇਨੋਨ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਜੋ ਹੈਰਾਨੀਜਨਕ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਕੰਪਲੈਕਸ ਸਰਗਰਮ ਹੈ, RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਾਲੋਂ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੱਲ ਕੀਤੇ QB ਕੁਇਨੋਨ ਦੇ ਨਾਲ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਦੋ LH1 ਰਿੰਗ ਲਗਭਗ ਛੇ ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਨੂੰ ਚੇਲੇਟ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਪੰਜ ਬੰਦ RC-LH116 ਰਿੰਗ ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੱਲ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਿਰਫ਼ ਤਿੰਨ ਖੁੱਲ੍ਹੇ RC-LH114-W ਰਿੰਗ ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੀਮਤ ਹਨ। ਇਹ ਵਧਿਆ ਹੋਇਆ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਕਾਰ RC-LH114-W QB ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਤਬਦੀਲੀ, ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਤੇਜ਼ ਕੁਇਨੋਨ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ, ਅਤੇ LH1 ਲੂਪ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ RC-LH114-W ਦੇ RC QB ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ UQ ਦੀ ਘਾਟ ਇੱਕ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸਰਗਰਮ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ RC-LH114-W ਦੀ QB ਸਾਈਟ ਨੂੰ UQ ਟਰਨਓਵਰ ਵਿੱਚ ਤੁਰੰਤ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਖਾਸ ਪੜਾਅ (QB ਸਾਈਟ ਦਾ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੁਆਰ ਬੰਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ) ਇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
QB ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ, L-Phe217 ਦਾ ਇੱਕ ਅਜਿਹੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਘੁੰਮਣਾ ਜੋ UQ10 ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਪੂਛ ਦੀ ਪਹਿਲੀ ਆਈਸੋਪ੍ਰੀਨ ਯੂਨਿਟ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਥਾਨਿਕ ਟੱਕਰ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗਾ (ਚਿੱਤਰ 6A)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਪੱਸ਼ਟ ਮੁੱਖ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਬਦਲਾਅ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹਨ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਹੈਲਿਕਸ ਡੀ (TMH D ਅਤੇ E ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਲੂਪ ਵਿੱਚ ਛੋਟਾ ਹੈਲਿਕਸ) ਜਿੱਥੇ L-Phe217 ਨੂੰ QB ਬਾਈਡਿੰਗ ਜੇਬ ਵਿੱਚ ਸ਼ਿਫਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ L-Tyr223 ਦਾ ਰੋਟੇਸ਼ਨ (ਚਿੱਤਰ 6A) M-Asp45 ਫਰੇਮਵਰਕ ਨਾਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਨੂੰ ਤੋੜਨ ਅਤੇ QB ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਦੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੁਆਰ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਨ ਲਈ (ਚਿੱਤਰ 6B)। ਹੈਲਿਕਸ ਡੀ ਇਸਦੇ ਅਧਾਰ 'ਤੇ ਪਿਵੋਟਸ ਕਰਦਾ ਹੈ, L-Ser209 ਦਾ Cα 0.33Å ਦੁਆਰਾ ਸ਼ਿਫਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ L-Val221Cα 3.52Å ਦੁਆਰਾ ਸ਼ਿਫਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। TMH D ਅਤੇ E ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਦੇਖਣਯੋਗ ਬਦਲਾਅ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਜੋ ਦੋਵਾਂ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਪਰਇੰਪੋਜ਼ੇਬਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 6A)। ਜਿੱਥੋਂ ਤੱਕ ਅਸੀਂ ਜਾਣਦੇ ਹਾਂ, ਇਹ ਕੁਦਰਤੀ RC ਵਿੱਚ ਪਹਿਲਾ ਢਾਂਚਾ ਹੈ ਜੋ QB ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਸੰਪੂਰਨ (QB-ਬਾਊਂਡ) ਢਾਂਚੇ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕੁਇਨੋਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਇਸਨੂੰ ਕੁਇਨੋਨ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। L-Phe217 ਕੁਇਨੋਨ ਹੈੱਡ ਗਰੁੱਪ ਨਾਲ ਇੱਕ π-ਸਟੈਕਿੰਗ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਘੁੰਮਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਹੈਲਿਕਸ ਬਾਹਰ ਵੱਲ ਸ਼ਿਫਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ L-Gly222 ਦੇ ਪਿੰਜਰ ਅਤੇ L-Tyr223 ਦੀ ਸਾਈਡ ਚੇਨ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਢਾਂਚੇ (ਚਿੱਤਰ 6, A ਅਤੇ C) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਨੈੱਟਵਰਕ ਬਣ ਸਕਦਾ ਹੈ।
(A) ਹੋਲੋਗ੍ਰਾਮ (L ਚੇਨ, ਸੰਤਰੀ/M ਚੇਨ, ਮੈਜੈਂਟਾ) ਅਤੇ apo (ਸਲੇਟੀ) ਢਾਂਚੇ ਦਾ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਕਾਰਟੂਨ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਇੱਕ ਡੰਡੇ ਵਰਗੀ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। UQ10 ਨੂੰ ਇੱਕ ਪੀਲੀ ਪੱਟੀ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ ਪੂਰੀ ਬਣਤਰ ਵਿੱਚ ਬਣੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। (B ਅਤੇ C) ਐਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਰਿੰਗ ਬਣਤਰ ਦੀ ਸਤਹ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧਤਾ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਨੀਲੇ ਵਿੱਚ L-Phe217 ਅਤੇ ਲਾਲ ਵਿੱਚ L-Tyr223 ਦੇ ਸਾਈਡ ਚੇਨ ਆਕਸੀਜਨ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦੀ ਹੈ। L ਸਬਯੂਨਿਟ ਸੰਤਰੀ ਹੈ; M ਅਤੇ H ਸਬਯੂਨਿਟ ਰੰਗੀਨ ਨਹੀਂ ਹਨ। (D ਅਤੇ E) ਐਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ (D) ਅਤੇ ਪੂਰਾ (E) RC QB ਸਾਈਟਾਂ [ਕ੍ਰਮਵਾਰ (A) ਦੁਆਰਾ ਰੰਗ] ਅਤੇ ਥਰਮੋਫਿਲਸ ਥਰਮੋਫਿਲਸ PSII (ਪਲਾਸਟਿਕ ਕੁਇਨੋਨ ਨਾਲ ਹਰਾ, ਨੀਲਾ; PDB ID: 3WU2) ਅਲਾਈਨ (58)।
ਅਚਾਨਕ, ਹਾਲਾਂਕਿ LH1 ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ QB-ਘਾਟ ਵਾਲੇ RCs ਦੇ ਕਈ ਢਾਂਚੇ ਉਪਲਬਧ ਹਨ, ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਬਦਲਾਅ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚ Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ਅਤੇ Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ਤੋਂ QB ਘਾਟਾ ਢਾਂਚਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸਾਰੇ ਲਗਭਗ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਮੁੱਚੇ QB ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹਨ। 3PRC ਦੇ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਨਿਰੀਖਣ ਤੋਂ ਪਤਾ ਲੱਗਾ ਕਿ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ਡਿਟਰਜੈਂਟ ਅਣੂ QB ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੁਆਰ 'ਤੇ ਬੰਨ੍ਹਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਬੰਦ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਵਿੱਚ ਪੁਨਰਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ LDAO 1EYS ਜਾਂ 1OGV ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਸੜਦਾ, ਇਹ RCs ਇੱਕੋ ਡਿਟਰਜੈਂਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਉਹੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। Rba ਦੀ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ। ਸਾਇਟੋਕ੍ਰੋਮ c2 (PDB ID: 1L9B) ਨਾਲ ਸਹਿ-ਕ੍ਰਿਸਟਲਾਈਜ਼ਡ ਸਫੈਰੋਇਡਜ਼ RC ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬੰਦ QB ਸਾਈਟ ਵੀ ਜਾਪਦੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, RC-M ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਦਾ N-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ (Q ਹੈਲਿਕਸ 'ਤੇ Tyr ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ H ਬਾਂਡ ਰਾਹੀਂ QB ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਨਾਲ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਨਾ) ਇੱਕ ਗੈਰ-ਕੁਦਰਤੀ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਨੂੰ ਅਪਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ QB ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਹੋਰ ਖੋਜ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ (30)। ਭਰੋਸਾ ਦੇਣ ਵਾਲੀ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਅਸੀਂ RC-LH114-W ਢਾਂਚੇ ਵਿੱਚ M ਪੌਲੀਪੇਪਟਾਈਡ ਦੇ ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ RC-LH116 RC ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਖੇਤਰ ਦੇ ਲਗਭਗ ਸਮਾਨ ਹੈ। ਇਹ ਵੀ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਡਿਟਰਜੈਂਟ-ਅਧਾਰਿਤ LH1 ਐਂਟੀਨਾ ਦੇ ਖਾਤਮੇ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, PDB ਵਿੱਚ ਐਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ RCs ਹੱਲ ਹੋ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਸਨੇ RC ਅਤੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ LH1 ਰਿੰਗ (31, 32) ਦੀ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸਤਹ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਪਾੜੇ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੁਇਨੋਨ ਪੂਲ ਅਤੇ ਲਿਪਿਡਸ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਸੀ। RC ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਸਾਰੇ ਸਹਿ-ਕਾਰਕਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ, ਸੜਨਯੋਗ QB ਕੁਇਨੋਨ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਜੋ ਕਿ ਘੱਟ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅਕਸਰ ਤਿਆਰੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਖਤਮ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (33)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RC ਤੋਂ LH1 ਅਤੇ ਕੁਦਰਤੀ ਚੱਕਰੀ ਲਿਪਿਡਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਨਾਲ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਾਰਜ-ਵੱਖ P+QB-ਸਟੇਟ ਦੀ ਛੋਟੀ ਉਮਰ (31, 34, 35)। ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ RC ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਸਥਾਨਕ LH1 ਰਿੰਗ ਦੀ ਹੋਂਦ "ਬੰਦ" QB ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ QB ਦੇ ਨੇੜੇ ਸਥਾਨਕ ਵਾਤਾਵਰਣ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ ਐਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ (QB ਕੁਇਨੋਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ) ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਬਣਤਰ QB ਸਾਈਟ ਦੇ ਟਰਨਓਵਰ ਦੇ ਸਿਰਫ ਦੋ ਸਨੈਪਸ਼ਾਟ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਇਸ ਗੱਲ ਦੇ ਸੰਕੇਤ ਹਨ ਕਿ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕੁਇਨੋਨ ਦੁਆਰਾ ਰੀਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਗੇਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਸਬਸਟਰੇਟ ਇਨਿਹਿਬਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ। ਐਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ QB ਸਾਈਟ ਦੇ ਨੇੜੇ ਕੁਇਨੋਲੋਲ ਅਤੇ ਕੁਇਨੋਨ ਦੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵੱਖਰਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਕਾਰਨ RC ਦੁਆਰਾ ਇਸਦੀ ਅਸਵੀਕਾਰਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਘਟਾਉਣ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ। ਹਨੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਜੰਮੇ ਹੋਏ RC ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ (36); ਐਕਸ-ਰੇ ਕ੍ਰਿਸਟਲੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਨੁਕਸਾਨ QB ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਦੇ ਸਰਗਰਮ ਪ੍ਰੌਕਸੀਮਲ ਸਥਿਤੀ (26) ਤੋਂ ਲਗਭਗ 4.5 Å "ਦੂਰ" ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਵਿੱਚ ਫਸਣ ਕਾਰਨ ਹੋਇਆ ਹੈ, 37)। ਅਸੀਂ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਹ ਦੂਰ-ਦੁਰਾਡੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਅਪੋਲੀਪੋਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਰਿੰਗ ਬਣਤਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵਿਚਕਾਰਲੀ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਇੱਕ ਸਨੈਪਸ਼ਾਟ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਕੁਇਨੋਨ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਅਤੇ QB ਸਾਈਟ ਦੇ ਖੁੱਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਕੁਝ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਅਤੇ ਸਾਇਨੋਬੈਕਟੀਰੀਆ, ਐਲਗੀ ਅਤੇ ਪੌਦਿਆਂ ਦੇ PSII ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਕਿਸਮ II RC ਵਿੱਚ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਸੰਭਾਲ ਹੈ (38)। ਚਿੱਤਰ 6 (D ਅਤੇ E) ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ PSII RCs ਅਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ RC ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ QB ਸਾਈਟ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਾਨਤਾ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਤੁਲਨਾ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਕੁਇਨੋਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਕਟੌਤੀ ਦੇ ਨਜ਼ਦੀਕੀ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਾਡਲ ਰਹੀ ਹੈ। ਪਿਛਲੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਨਾਂ ਨੇ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਸੀ ਕਿ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਕੁਇਨੋਨਾਂ ਦੀ PSII ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ (39, 40)। ਇਸ ਲਈ, RC ਦੇ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਸੰਭਾਲ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਅਣਦੇਖਿਆ ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਧੀ ਆਕਸੀਜਨ ਵਾਲੇ ਫੋਟੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਪੌਦਿਆਂ ਵਿੱਚ PSII RC ਦੀ QB ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਵੀ ਲਾਗੂ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
Rps ΔpufW (ਬਿਨਾਂ ਲੇਬਲ ਵਾਲਾ pufW ਡਿਲੀਸ਼ਨ) ਅਤੇ PufW-His (C-ਟਰਮੀਨਲ 10x His-ਟੈਗਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਕੁਦਰਤੀ pufW ਲੋਕਸ ਤੋਂ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਸਟ੍ਰੇਨ। palustris CGA009 ਦਾ ਵਰਣਨ ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਕੰਮ (16) ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹਨਾਂ ਸਟ੍ਰੇਨ ਅਤੇ ਆਈਸੋਜੇਨਿਕ ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ ਪੇਰੈਂਟ ਨੂੰ ਫ੍ਰੀਜ਼ਰ ਤੋਂ PYE (ਹਰੇਕ 5 g ਲੀਟਰ -1) (-80 °C 'ਤੇ LB ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 50% (w/v) ਗਲਿਸਰੋਲ) ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਖਮੀਰ ਐਬਸਟਰੈਕਟ ਅਤੇ ਸੁਕਸੀਨੇਟ) ਅਗਰ [1.5% (w/v)] ਪਲੇਟ ਸ਼ਾਮਲ ਸੀ, 'ਤੇ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸਟ੍ਰੀਕ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਐਨਾਇਰੋਬਿਕ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਰਾਤ ਭਰ ਇੰਕੂਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ OSRAM 116-W ਹੈਲੋਜਨ ਬਲਬ (RS ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ, UK) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਚਿੱਟੀ ਰੌਸ਼ਨੀ (~50 μmolm-2 s-1) ਨਾਲ 3 ਤੋਂ 5 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਮਾਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਇੱਕ ਵੀ ਕਲੋਨੀ ਦਿਖਾਈ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦੀ। ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਕਲੋਨੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 10 ਮਿਲੀਲੀਟਰ M22+ ਮੀਡੀਅਮ (41) ਨੂੰ 0.1% (w/v) ਕੈਸਾਮਿਨੋ ਐਸਿਡ (ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ M22 ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਟੀਕਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਘੱਟ ਆਕਸੀਜਨ ਵਾਲੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 34°C 'ਤੇ 180 rpm 'ਤੇ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਹਿੱਲਦੇ ਹੋਏ ਉਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 70 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਕਲਚਰ ਨੂੰ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਉਸੇ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਅਰਧ-ਏਰੋਬਿਕ ਕਲਚਰ 30 ਮਿਲੀਲੀਟਰ M22 ਮੀਡੀਅਮ ਨੂੰ 30 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਯੂਨੀਵਰਸਲ ਸਕ੍ਰੂ-ਟੌਪ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਕੱਚ ਦੀ ਬੋਤਲ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਨਿਰਜੀਵ ਚੁੰਬਕੀ ਬਲ ਸਟਰਿੰਗ ਰਾਡ ਦੁਆਰਾ 48 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਅੰਦੋਲਨ (~50μmolm-2 s-1) ਨਾਲ ਕਿਰਨੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ 30 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਉਸੇ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 1 ਲੀਟਰ ਕਲਚਰ ਨਾਲ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਫਿਰ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ~200 μmolm-2 s-1 'ਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਮਾਨ ਲਗਭਗ 9 ਲੀਟਰ ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਟੀਕਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 7132 RCF 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 20 mM ਟ੍ਰਿਸ-HCl (pH 8.0) ਦੇ ~10 ml ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਲੋੜ ਪੈਣ ਤੱਕ -20°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਪਿਘਲਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਡੀਆਕਸੀਰੀਬੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ I (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ), ਲਾਈਸੋਜ਼ਾਈਮ (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਅਤੇ ਦੋ ਰੋਸ਼ ਹੋਲੋਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਗੋਲੀਆਂ (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਦੇ ਕੁਝ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ। 20,000 psi ਫ੍ਰੈਂਚ ਪ੍ਰੈਸ਼ਰ ਸੈੱਲ (ਅਮਿੰਕੋ, ਯੂਐਸਏ) ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 8 ਤੋਂ 12 ਵਾਰ ਵਿਘਨ ਪਾਇਆ ਗਿਆ। 4°C 'ਤੇ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ 18,500 RCF 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਅਟੁੱਟ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਮਲਬੇ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਪਿਗਮੈਂਟਡ ਲਾਈਸੇਟ ਤੋਂ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ 113,000 RCF 'ਤੇ 43,000°C 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਅੰਸ਼ ਨੂੰ ਛੱਡ ਦਿਓ ਅਤੇ ਰੰਗੀਨ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 100 ਤੋਂ 200 ਮਿਲੀਲੀਟਰ 20 mM ਟ੍ਰਿਸ-HCl (pH 8.0) ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕਰੋ ਅਤੇ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਸਮਰੂਪ ਕਰੋ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਕੋਈ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣ ਵਾਲਾ ਸਮੂਹ ਨਾ ਹੋਵੇ। ਮੁਅੱਤਲ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ਵਿੱਚ 2% (w/v) β-DDM ਵਾਲੇ 4°C 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਹਲਕੇ ਹਿਲਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ 70°C 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰਕੇ 150,000 RCF ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਘੋਲ ਕੇ ਬਚੇ ਹੋਏ ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪਦਾਰਥਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਓ।
ΔpufW ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 50 ਮਿਲੀਲੀਟਰ DEAE ਸੇਫਾਰੋਜ਼ ਆਇਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਕਾਲਮ 'ਤੇ ਤਿੰਨ ਕਾਲਮ ਵਾਲੀਅਮ (CV) ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ [20 mM ਟ੍ਰਿਸ-HCl (pH 8.0) ਜਿਸ ਵਿੱਚ 0.03% (w/v) β-DDM] ਸੀ, ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਦੋ CV ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰਾਂ ਨਾਲ ਧੋਵੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਕਾਲਮ ਨੂੰ 50 mM NaCl ਵਾਲੇ ਦੋ ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰਾਂ ਨਾਲ ਧੋਵੋ। RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ 1.75 CV 'ਤੇ 150 ਤੋਂ 300 mM NaCl (ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ) ਦੇ ਇੱਕ ਲੀਨੀਅਰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਾਲ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਬਾਕੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ 0.5 CV 'ਤੇ 300 mM NaCl ਵਾਲੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਨਾਲ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 250 ਅਤੇ 1000 nm ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ, ਸੋਖਣ ਅਨੁਪਾਤ (A880/A280) ਵਾਲੇ ਅੰਸ਼ ਨੂੰ 1 ਤੋਂ ਵੱਧ 880 ਤੋਂ 280 nm 'ਤੇ ਰੱਖੋ, ਇਸਨੂੰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਦੋ ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ DEAE ਕਾਲਮ 'ਤੇ ਦੁਬਾਰਾ ਉਹੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਰਤੋ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ 'ਤੇ। 1.7 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A280 ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ 3.0 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A805 ਅਨੁਪਾਤ ਵਾਲੇ ਅੰਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕਰੋ, ਆਇਨ ਐਕਸਚੇਂਜ ਦਾ ਤੀਜਾ ਦੌਰ ਕਰੋ, ਅਤੇ 2.2 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A280 ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ 5.0 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A805 ਅਨੁਪਾਤ ਵਾਲੇ ਅੰਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖੋ। ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਇੱਕ Amicon 100,000 ਅਣੂ ਭਾਰ ਕੱਟ-ਆਫ (MWCO) ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗਲ ਫਿਲਟਰ (Merck, UK) ਵਿੱਚ ~2 ml ਤੱਕ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਇੱਕ Superdex 200 16/600 ਆਕਾਰ ਦੇ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਕਾਲਮ (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ, US) 'ਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 200 mM NaCl ਬਫਰ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਉਸੇ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1.5 CV 'ਤੇ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਆਕਾਰ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਐਬਸੋਰਪਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਐਬਸੋਰਪਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ 2.4 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A280 ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ 5.8 ਤੋਂ 100 A880 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A805 ਅਨੁਪਾਤ ਨਾਲ ਸੈਂਟਰਿਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਤੁਰੰਤ ਕ੍ਰਾਇਓ-TEM ਗਰਿੱਡ ਤਿਆਰੀ ਜਾਂ ਸਟੋਰੇਜ ਲਈ ਵਰਤੋ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਲੋੜ ਨਾ ਪਵੇ -80°C 'ਤੇ ਰੱਖੋ।
PufW-His ਸਟ੍ਰੇਨ ਤੋਂ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 20 ਮਿਲੀਲੀਟਰ HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ਕਾਲਮ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ਜਿਸ ਵਿੱਚ 200 mM NaCl ਅਤੇ 0.03% (w/w)) IMAC ਬਫਰ (GE Healthcare) ਵਿੱਚ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। v) β-DDM]। ਕਾਲਮ ਨੂੰ IMAC ਬਫਰ ਦੇ ਪੰਜ CVs ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 10 mM ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਵਾਲੇ IMAC ਬਫਰ ਦੇ ਪੰਜ CVs ਨਾਲ। ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ 100 mM ਹਿਸਟਿਡਾਈਨ ਵਾਲੇ ਪੰਜ IMAC ਬਫਰਾਂ ਨਾਲ ਕਾਲਮ ਤੋਂ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਾਲਾ ਫਰੈਕਸ਼ਨ ਇੱਕ Amicon 100,000 MWCO ਫਿਲਟਰ (Merck, UK) ਨਾਲ ਲੈਸ ਇੱਕ ਸਟਰਾਈਡ ਟੈਂਕ ਵਿੱਚ ~10 ml ਤੱਕ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਨਾਲ 20 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ 25 ml ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। DEAE Sepharose ਕਾਲਮ ਵਿੱਚ, ਬਫਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਚਾਰ CVs ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਚਾਰ CV ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰਾਂ ਨਾਲ ਧੋਵੋ, ਫਿਰ 0 ਤੋਂ 100 mM NaCl (ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਵਿੱਚ) ਦੇ ਲੀਨੀਅਰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ 'ਤੇ ਅੱਠ CV 'ਤੇ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਐਲੂਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਬਾਕੀ ਚਾਰ CV ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ 100 mM ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਹੈ। ਸੋਡੀਅਮ ਕਲੋਰਾਈਡ 'ਤੇ ਐਲੂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਬਾਕੀ ਕੰਪਲੈਕਸ 2.4 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A280 ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ 4.6 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A805 ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾਏ ਗਏ ਸਨ, ਨੂੰ ਇੱਕ Amicon 100,000 MWCO ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗਲ ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚ ~2 ਮਿ.ਲੀ. ਤੱਕ ਕੇਂਦ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ 1.5 CV IMAC ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਫਰ ਨੇ ਸੁਪਰਡੈਕਸ 200 16/600 ਆਕਾਰ ਦੇ ਐਕਸਕਲੂਜ਼ਨ ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਸੰਤੁਲਿਤ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਫਿਰ 1.5 CV ਤੋਂ ਵੱਧ ਉਸੇ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਐਲੂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਆਕਾਰ-ਬਾਹਰ ਕੱਢਣ ਵਾਲੇ ਅੰਸ਼ਾਂ ਦੇ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ ਅਤੇ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ 2.1 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A280 ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ 4.6 ਤੋਂ 100 A880 ਤੋਂ ਵੱਧ A880/A805 ਅਨੁਪਾਤ ਨਾਲ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕਰੋ, ਜੋ ਤੁਰੰਤ ਜੰਮੇ ਹੋਏ TEM ਗਰਿੱਡ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਜਾਂ ਲੋੜ ਪੈਣ ਤੱਕ -80°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ ਵਾਲੇ TEM ਗਰਿੱਡ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ Leica EM GP ਇਮਰਸ਼ਨ ਫ੍ਰੀਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ IMAC ਬਫਰ ਵਿੱਚ 50 ਦੇ A880 ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 5μl ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਗਲੋ-ਡਿਸਚਾਰਜਡ QUANTIFOIL 1.2/1.3 ਕਾਰਬਨ-ਕੋਟੇਡ ਤਾਂਬੇ ਦੇ ਜਾਲ (Agar Scientific, UK) 'ਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਗਰਿੱਡ ਨੂੰ 20°C ਅਤੇ 60% ਸਾਪੇਖਿਕ ਨਮੀ 'ਤੇ 30 ਸਕਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕਰੋ, ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ 3 ਸਕਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੁਕਾਓ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ -176°C 'ਤੇ ਤਰਲ ਈਥੇਨ ਵਿੱਚ ਬੁਝਾਓ।
RC-LH114-W ਕੰਪਲੈਕਸ ਦਾ ਡੇਟਾ eBIC (ਇਲੈਕਟ੍ਰਾਨਿਕ ਬਾਇਓਇਮੇਜਿੰਗ ਸੈਂਟਰ) (ਬ੍ਰਿਟਿਸ਼ ਡਾਇਮੰਡ ਲਾਈਟ ਸੋਰਸ) 'ਤੇ ਟਾਈਟਨ ਕ੍ਰਿਓਸ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਨਾਲ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ 300kV ਦੇ ਐਕਸਲਰੇਟਿੰਗ ਵੋਲਟੇਜ 'ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਨਾਮਾਤਰ ਵਿਸਤਾਰ 130,000× ਹੈ ਅਤੇ ਊਰਜਾ - 20 eV ਦਾ ਇੱਕ ਪਾੜਾ ਚੁਣੋ। ਡੇਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਉਂਟਿੰਗ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ Gatan 968 GIF ਕੁਆਂਟਮ K2 ਪੀਕ ਡਿਟੈਕਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਕੈਲੀਬਰੇਟ ਕੀਤਾ ਪਿਕਸਲ ਆਕਾਰ 1.048Å ਹੈ, ਅਤੇ ਖੁਰਾਕ ਦਰ 3.83 e-Å-2s-1 ਹੈ। 11 ਸਕਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਫਿਲਮ ਇਕੱਠੀ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ 40 ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ। ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਨੂੰ ਰੀਫੋਕਸ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਰਬਨ-ਕੋਟੇਡ ਖੇਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰਤੀ ਛੇਕ ਤਿੰਨ ਫਿਲਮਾਂ ਇਕੱਠੀਆਂ ਕਰੋ। ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, 3130 ਫਿਲਮਾਂ ਇਕੱਠੀਆਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਡੀਫੋਕਸ ਮੁੱਲ -1 ਅਤੇ -3μm ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਨ।
RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ ਲਈ ਡੇਟਾ ਐਸਟਰਬਰੀ ਬਾਇਓਸਟ੍ਰਕਚਰ ਲੈਬਾਰਟਰੀ (ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਆਫ਼ ਲੀਡਜ਼, ਯੂਕੇ) ਵਿਖੇ ਉਸੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਡੇਟਾ ਨੂੰ 130 k ਦੇ ਵਿਸਤਾਰ ਨਾਲ ਕਾਉਂਟਿੰਗ ਮੋਡ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਪਿਕਸਲ ਆਕਾਰ ਨੂੰ 4.6 e-Å-2s-1 ਦੀ ਖੁਰਾਕ ਨਾਲ 1.065 Å ਤੱਕ ਕੈਲੀਬਰੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਲਮ ਨੂੰ 12 ਸਕਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 48 ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, 3359 ਫਿਲਮਾਂ ਇਕੱਠੀਆਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਡੀਫੋਕਸ ਮੁੱਲ -1 ਅਤੇ -3μm ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਨ।
ਸਾਰਾ ਡਾਟਾ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ Relion 3.0 ਪਾਈਪਲਾਈਨ (42) ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਖੁਰਾਕ ਭਾਰ ਦੁਆਰਾ ਬੀਮ ਮੋਸ਼ਨ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰਨ ਲਈ Motioncorr 2 (43) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ CTF (ਕੰਟਰਾਸਟ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਫੰਕਸ਼ਨ) ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ CTFFIND 4.1 (44) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਇਹਨਾਂ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਪੜਾਵਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਮ ਫੋਟੋਮਾਈਕ੍ਰੋਗ੍ਰਾਫ ਚਿੱਤਰ 2. S16 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਚੋਣ ਟੈਂਪਲੇਟ 250-ਪਿਕਸਲ ਫਰੇਮ ਵਿੱਚ 1000 ਕਣਾਂ ਦੇ ਲਗਭਗ 250 ਪਿਕਸਲ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਚੁਣ ਕੇ ਅਤੇ ਕੋਈ ਹਵਾਲਾ ਦੋ-ਅਯਾਮੀ (2D) ਵਰਗੀਕਰਣ ਨਹੀਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉਹਨਾਂ ਵਰਗੀਕਰਣਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਨਮੂਨਾ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜਾਂ ਕੋਈ ਸਪਸ਼ਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨਹੀਂ ਹਨ। ਫਿਰ, ਸਾਰੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਫੋਟੋਗ੍ਰਾਫਾਂ 'ਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਗਈ, ਅਤੇ RC-LH114-W 849,359 ਕਣ ਸਨ, ਅਤੇ RC-LH116 ਕੰਪਲੈਕਸ 476,547 ਕਣ ਸਨ। ਸਾਰੇ ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਕਣਾਂ ਨੇ ਗੈਰ-ਸੰਦਰਭ 2D ਵਰਗੀਕਰਨ ਦੇ ਦੋ ਦੌਰਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਗੁਜ਼ਰਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਦੌੜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕਾਰਬਨ ਖੇਤਰ, ਨਮੂਨਾ ਗੰਦਗੀ, ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਜਾਂ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਓਵਰਲੈਪਿੰਗ ਕਣਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕਣਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 772,033 (90.9%) ਅਤੇ 359,678 (75.5%) ਕਣਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ RC-LH114-W ਅਤੇ RC-LH116 ਦੇ 3D ਵਰਗੀਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ 3D ਸੰਦਰਭ ਮਾਡਲ ਸਟੋਚੈਸਟਿਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਡਿਸੈਂਟ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ, ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਕਣਾਂ ਨੂੰ 3D ਵਿੱਚ ਚਾਰ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਇਸ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ, ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡੀ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਕਣਾਂ 'ਤੇ 3D ਰਿਫਾਈਨਿੰਗ ਕਰੋ, ਫਿਰ ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰਨ ਲਈ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ 15Å ਲੋ-ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਨਰਮ ਕਿਨਾਰਿਆਂ ਦੇ 6 ਪਿਕਸਲ ਜੋੜੋ, ਅਤੇ ਚੋਟੀ ਦੇ ਡਿਟੈਕਟਰ ਦੇ Gatan K2 ਪੀਕ ਮੋਡੂਲੇਸ਼ਨ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰਨ ਲਈ ਪਿਕਸਲ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਤੋਂ ਬਾਅਦ। RC-LH114-W ਡੇਟਾਸੈਟ ਲਈ, ਇਸ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਮਾਸਕ ਦੇ ਕਿਨਾਰਿਆਂ 'ਤੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਘਣਤਾ ਨੂੰ ਹਟਾ ਕੇ ਸੋਧਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (UCSF Chimera ਵਿੱਚ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਘਣਤਾ ਤੋਂ ਡਿਸਕਨੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ)। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਆਉਣ ਵਾਲੇ ਮਾਡਲ (RC-LH114-W ਅਤੇ RC-LH116 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 3.91 ਅਤੇ 4.16 Å ਹਨ) ਨੂੰ 3D ਵਰਗੀਕਰਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਲਈ ਇੱਕ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਵਰਤੇ ਗਏ ਕਣਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ 3D ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਸਮੂਹਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਆਂਢ-ਗੁਆਂਢ ਨਾਲ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਬੰਧ ਨਹੀਂ ਹਨ। ਸਪੱਸ਼ਟ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਓਵਰਲੈਪ ਜਾਂ ਘਾਟ। 3D ਵਰਗੀਕਰਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਵਾਲੀ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਚੁਣੀ ਗਈ ਸੀ [RC-LH114-W ਲਈ, ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ 377,703 ਕਣ (44.5%) ਹੈ, RC-LH116 ਲਈ, ਦੋ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਹਨ, ਕੁੱਲ 260,752 ਕਣ (54.7%) ਹਨ, ਜਿੱਥੇ ਉਹ ਸਿਰਫ਼ ਉਦੋਂ ਹੀ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਘੁੰਮਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਫਰਕ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ]। ਚੁਣੇ ਹੋਏ ਕਣਾਂ ਨੂੰ 400-ਪਿਕਸਲ ਬਾਕਸ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਕੱਢਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 3D ਰਿਫਾਇਨਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਰਿਫਾਇਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਘੋਲਕ ਮਾਸਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ 15Å ਲੋ-ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ, 3 ਪਿਕਸਲ ਮੈਪ ਐਕਸਪੈਂਸ਼ਨ ਅਤੇ 3 ਪਿਕਸਲ ਸਾਫਟ ਮਾਸਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਪ੍ਰਤੀ-ਕਣ CTF ਰਿਫਾਇਨਮੈਂਟ, ਪ੍ਰਤੀ-ਕਣ ਗਤੀ ਸੁਧਾਰ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀ-ਕਣ CTF ਰਿਫਾਇਨਮੈਂਟ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, 3D ਰਿਫਾਇਨਮੈਂਟ, ਘੋਲਕ ਮਾਸਕਿੰਗ ਅਤੇ ਪੋਸਟ-ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਹਰੇਕ ਕਦਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਹੋਰ ਸੁਧਾਰਨ ਲਈ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। 0.143 ਦੇ FSC (ਫੂਰੀਅਰ ਸ਼ੈੱਲ ਸਹਿ-ਸੰਬੰਧ ਗੁਣਾਂਕ) ਕੱਟ-ਆਫ ਮੁੱਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, RC-LH114-W ਅਤੇ RC-LH116 ਦੇ ਅੰਤਿਮ ਮਾਡਲਾਂ ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 2.65 ਅਤੇ 2.80Å ਹਨ। ਅੰਤਿਮ ਮਾਡਲ ਦਾ FSC ਕਰਵ ਚਿੱਤਰ 2. S17 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਸਾਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ UniProtKB ਤੋਂ ਡਾਊਨਲੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)। SWISS-MODEL (45) ਦੀ ਵਰਤੋਂ RC ਦੇ ਇੱਕ ਸਮਰੂਪ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ RC-L, RC-M ਅਤੇ RC-H ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ Rba ਦੀ ਕ੍ਰਿਸਟਲ ਬਣਤਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ। sphaeroides RC ਨੂੰ ਇੱਕ ਟੈਂਪਲੇਟ (PDB ID: 5LSE) (46) ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। UCSF Chimera ਵਿੱਚ "ਫਿੱਟ ਮੈਪ" ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਨਕਸ਼ੇ (47) ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਕਰੋ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਓ, ਅਤੇ ਕੋਫੈਕਟਰ [4×BChl a (ਮੋਨੋਮਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਨਾਮ = BCL), 2×BPh a (BPH), ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਦੇ UQ10 (U10), ਇੱਕ ਗੈਰ-ਹੀਮ ਆਇਰਨ (Fe) ਅਤੇ ਇੱਕ 3,4-ਡਾਈਹਾਈਡ੍ਰੋਹੈਕਸਾਕਾਰਬੋਨੀਲਕੋਲੀਨ (QAK)] ਜੋੜਨ ਲਈ Coot (48) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਕਿਉਂਕਿ QAK ਮੋਨੋਮਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਵਿੱਚ ਉਪਲਬਧ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇਸਨੂੰ PHENIX (49) ਵਿੱਚ eLBOW ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅੱਗੇ, LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ। ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ, PHENIX (49) ਵਿੱਚ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਕੰਸਟ੍ਰਕਸ਼ਨ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਕਸ਼ੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ LH1 ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ LH1-α ਅਤੇ LH1-β ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕ੍ਰਮ ਇਨਪੁਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਸਭ ਤੋਂ ਸੰਪੂਰਨ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਚੁਣੋ, ਇਸਨੂੰ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰੋ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ Coot ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕਰੋ, ਇਸ ਵਿੱਚ ਗੁੰਮ ਹੋਏ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਦੋ BCls a (BCL) ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਪਿਰਿਲੌਕਸੈਂਥਿਨ (CRT) ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਪੂਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਸੁਧਾਰੋ [ਸੰਬੰਧਿਤ Rps ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਘਣਤਾ ਅਤੇ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ ਸਮੱਗਰੀ। ਸਪੀਸੀਜ਼ (17)]। ਪੂਰੇ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰੋ, ਅਤੇ LH1 ਘਣਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਗੈਰ-ਮਾਡਲ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਡੌਕ ਕਰਨ ਲਈ UCSF ਚਾਈਮੇਰਾ "ਡੌਕਿੰਗ ਮੈਪ ਟੂਲ" ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ Coot ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰੋ; ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਉਦੋਂ ਤੱਕ ਦੁਹਰਾਓ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸਾਰੇ LH1 ਸਬਯੂਨਿਟ ਮਾਡਲ ਨਹੀਂ ਹੋ ਜਾਂਦੇ। RC-LH114-W ਢਾਂਚੇ ਲਈ, ਕੂਟ ਵਿੱਚ ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਘਣਤਾ ਨੂੰ ਕੱਢ ਕੇ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ USCF ਚਾਈਮੇਰਾ ਨਕਸ਼ੇ ਵਿੱਚ ਬਾਕੀ ਗੈਰ-ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹਿੱਸਿਆਂ ਤੋਂ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਆਟੋਬਿਲਡ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਮਾਡਲ, ਅਤੇ ਬਾਕੀ ਸਬਯੂਨਿਟ (ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W) ਮਾਡਲਿੰਗ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। PHENIX (49) ਵਿੱਚ। ਕੂਟ (48) ਵਿੱਚ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਵੀ ਗੁੰਮ ਹੋਏ ਕ੍ਰਮ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪੂਰੇ ਸਬਯੂਨਿਟ ਨੂੰ ਹੱਥੀਂ ਸੁਧਾਰੋ। ਬਾਕੀ ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਘਣਤਾ ਲਿਪਿਡਾਂ (CDL = CDL, POPC = 6PL ਅਤੇ POPG = PGT ਦੀ PDB ਮੋਨੋਮਰ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ID), β-DDM ਡਿਟਰਜੈਂਟ (LMT) ਅਤੇ UQ10 ਅਣੂ (U10) ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਬੈਠਦੀ ਹੈ। ਮਾਡਲ ਦੇ ਅੰਕੜਿਆਂ ਅਤੇ ਫਿੱਟ ਦੀ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਸੁਧਾਰ ਨਾ ਹੋਣ ਤੱਕ ਸੰਪੂਰਨ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਮਾਡਲ ਨੂੰ ਸੰਪੂਰਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕੂਟ (49) ਅਤੇ ਮੈਨੂਅਲ ਓਪਟੀਮਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਸਥਾਨਕ ਨਕਸ਼ੇ ਨੂੰ ਤਿੱਖਾ ਕਰਨ ਲਈ LocScale (50) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਅਣ-ਨਿਰਧਾਰਤ ਘਣਤਾ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਅਤੇ ਮੈਨੂਅਲ ਓਪਟੀਮਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੇ ਮਾਡਲਿੰਗ ਦੇ ਕਈ ਹੋਰ ਚੱਕਰ ਕਰੋ।
ਸੰਬੰਧਿਤ ਪੇਪਟਾਇਡਸ, ਕੋਫੈਕਟਰ ਅਤੇ ਹੋਰ ਲਿਪਿਡਸ ਅਤੇ ਕੁਇਨੋਨਸ ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸੰਬੰਧਿਤ ਘਣਤਾ ਦੇ ਅੰਦਰ ਡੌਕ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਚਿੱਤਰ 1 ਅਤੇ 2 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ। S18 ਤੋਂ S23। ਅੰਤਿਮ ਮਾਡਲ ਦੀ ਅੰਕੜਾ ਜਾਣਕਾਰੀ ਸਾਰਣੀ S1 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।
ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਹੋਰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ, UV/Vis/NIR ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ Cary60 ਸਪੈਕਟਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ (Agilent, USA) 'ਤੇ 250 nm ਤੋਂ 1000 nm ਤੱਕ 1 nm ਅੰਤਰਾਲਾਂ ਅਤੇ 0.1s ਦੇ ਏਕੀਕਰਨ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 1 ਦੇ A880 ਤੱਕ 2 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਮਾਰਗ ਵਾਲੇ ਕੁਆਰਟਜ਼ ਕਿਊਵੇਟ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ 400 ਅਤੇ 1000 nm ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ। ਗੋਲਾਕਾਰ ਡਾਇਕ੍ਰੋਇਕ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਜੈਸਕੋ 810 ਸਪੈਕਟਰੋਪੋਲਾਰੀਮੀਟਰ (ਜੈਸਕੋ, ਜਾਪਾਨ) 'ਤੇ 400 nm ਅਤੇ 950 nm ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ 1 nm ਅੰਤਰਾਲ 'ਤੇ 20 nm ਘੱਟੋ-1 ਦੀ ਸਕੈਨ ਦਰ 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਮੋਲਰ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਗੁਣਾਂਕ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 50 ਦੇ A880 ਤੱਕ ਪਤਲਾ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। 990μl ਬਾਈਡਿੰਗ ਬਫਰ ਜਾਂ ਮੀਥੇਨੌਲ ਵਿੱਚ 10μl ਵਾਲੀਅਮ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ BChl ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਤੁਰੰਤ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਇਕੱਠਾ ਕਰੋ। ਹਰੇਕ ਮੀਥੇਨੌਲ ਨਮੂਨੇ ਦੀ BChl ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਗਣਨਾ 54.8 mM-1 cm-1 ਦੇ 771 nm 'ਤੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਗੁਣਾਂਕ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਗੁਣਾਂਕ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (51)। ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਪੀ ਗਈ BChl ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ 32 (RC-LH114-W) ਜਾਂ 36 (RC-LH116) ਨਾਲ ਵੰਡੋ, ਜਿਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਫਿਰ ਬਫਰ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਗੁਣਾਂਕ ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਉਸੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਸੋਖਣ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਸਮਾਨਾਂਤਰ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਵਾਰ ਮਾਪ ਲਏ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਗਣਨਾ ਲਈ BChl Qy ਅਧਿਕਤਮ ਦੀ ਔਸਤ ਸੋਖਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। 878 nm 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ RC-LH114-W ਦਾ ਵਿਨਾਸ਼ ਗੁਣਾਂਕ 3280±140 mM-1 cm-1 ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ 880 nm 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ RC-LH116 ਦਾ ਵਿਨਾਸ਼ ਗੁਣਾਂਕ 3800±30 mM-1 cm-1 ਹੈ।
UQ10 ਨੂੰ (52) ਵਿੱਚ ਦਿੱਤੇ ਢੰਗ ਅਨੁਸਾਰ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਰਿਵਰਸ ਫੇਜ਼ HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। RC-LH116 ਜਾਂ RC-LH114-W ਦੇ ਲਗਭਗ 0.02 nmol ਨੂੰ 50:50 ਮੀਥੇਨੌਲ ਦੇ 50μl ਵਿੱਚ ਘੋਲੋ: 0.02% (w/v) ਫੈਰਿਕ ਕਲੋਰਾਈਡ ਵਾਲਾ ਕਲੋਰੋਫਾਰਮ, ਅਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਸੰਤੁਲਿਤ ਬੈਕਮੈਨ ਕੌਲਟਰ ਅਲਟਰਾਸਫੀਅਰ ODS 4.6 mm ਨੂੰ ×25 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਕਾਲਮ 'ਤੇ HPLC ਘੋਲਕ (80:20 ਮੀਥੇਨੌਲ:2-ਪ੍ਰੋਪਾਨੋਲ) ਵਿੱਚ 40°C 'ਤੇ 1 ml-1 min-1 ਵਿੱਚ ਘੋਲੋ। 275 nm (UQ10), 450 nm (ਕੈਰੋਟੀਨੋਇਡ) ਅਤੇ 780 nm (BChl) 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਸੋਖਣ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ HPLC ਘੋਲਕ ਵਿੱਚ ਆਈਸੋਕ੍ਰੇਟਿਕ ਐਲੂਸ਼ਨ ਕਰੋ। 25.5 ਮਿੰਟਾਂ 'ਤੇ 275 nm ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਮ ਵਿੱਚ ਸਿਖਰ ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਹੋਰ ਖੋਜਣਯੋਗ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨਹੀਂ ਸਨ। ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਖੇਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 0 ਤੋਂ 5.8 nmol (ਚਿੱਤਰ S14) ਤੱਕ ਸ਼ੁੱਧ ਮਿਆਰਾਂ ਦੇ ਟੀਕੇ ਤੋਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦੇ ਹਵਾਲੇ ਨਾਲ ਕੱਢੇ ਗਏ UQ10 ਦੀ ਮੋਲਰ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਗਲਤੀ ਔਸਤ ਦੇ SD ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ।
RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਘੋਲ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ Qy ਸੋਖਣ 0.1 ਸੀ, 30 μM ਘਟਾਏ ਹੋਏ ਘੋੜੇ ਦੇ ਦਿਲ ਸਾਇਟੋਕ੍ਰੋਮ c2 (Merck, UK) ਅਤੇ 0 ਤੋਂ 50 μMUQ2 (Merck, UK) ਨਾਲ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਹਰੇਕ UQ2 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਤਿੰਨ 1-ml ਨਮੂਨੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਮਾਪ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਰਾਤ ਭਰ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 4°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਘੋਲ ਨੂੰ ਇੱਕ OLIS RSM1000 ਮਾਡਿਊਲਰ ਸਪੈਕਟਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ 300 nm ਫਲੇਮ/500 ਲਾਈਨ ਗਰੇਟਿੰਗ, 1.24 mm ਇਨਲੇਟ, 0.12 mm ਮੱਧ ਅਤੇ 0.6 mm ਆਊਟਲੈੱਟ ਸਲਿਟਸ ਨਾਲ ਲੈਸ ਸੀ। ਨਮੂਨਾ ਫੋਟੋਟਿਊਬ ਅਤੇ ਸੰਦਰਭ ਫੋਟੋਮਲਟੀਪਲਾਇਰ ਟਿਊਬ ਦੇ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਦੁਆਰ 'ਤੇ ਇੱਕ 600 nm ਲੰਬਾ ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਉਤੇਜਨਾ ਰੌਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਿਆ ਜਾ ਸਕੇ। ਸੋਖਣ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ 550 nm 'ਤੇ 0.15 s ਦੇ ਏਕੀਕਰਨ ਸਮੇਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ ਲਾਈਟ 880 nm M880F2 LED (ਲਾਈਟ ਐਮੀਟਿੰਗ ਡਾਇਓਡ) (ਥੋਰਲੈਬਸ ਲਿਮਟਿਡ, ਯੂਕੇ) ਤੋਂ 90% ਤੀਬਰਤਾ 'ਤੇ ਇੱਕ ਫਾਈਬਰ ਆਪਟਿਕ ਕੇਬਲ ਰਾਹੀਂ ਇੱਕ DC2200 ਕੰਟਰੋਲਰ (ਥੋਰਲੈਬਸ ਲਿਮਟਿਡ, ਯੂਕੇ) ਰਾਹੀਂ ਨਿਕਲਦੀ ਹੈ ਅਤੇ 90° ਦੇ ਕੋਣ 'ਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸਰੋਤ ਵੱਲ ਨਿਕਲਦੀ ਹੈ। ਮਾਪਣ ਵਾਲੀ ਬੀਮ ਸ਼ੀਸ਼ੇ ਦੇ ਉਲਟ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਕਿਸੇ ਵੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਵਾਪਸ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ ਜੋ ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ ਨਮੂਨੇ ਦੁਆਰਾ ਸੋਖ ਨਹੀਂ ਗਈ ਸੀ। 50 ਸਕਿੰਟ ਦੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 10 ਸਕਿੰਟ ਸੋਖਣ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰੋ। ਫਿਰ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 60 ਸਕਿੰਟ ਲਈ ਸੋਖਣ ਦੀ ਹੋਰ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਕੁਇਨੋਲੋਲ ਆਪਣੇ ਆਪ ਸਾਈਟੋਕ੍ਰੋਮ c23 + ਨੂੰ ਕਿਸ ਹੱਦ ਤੱਕ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ (ਕੱਚੇ ਡੇਟਾ ਲਈ ਚਿੱਤਰ S8 ਵੇਖੋ)।
ਡੇਟਾ ਨੂੰ 0.5 ਤੋਂ 10 ਸਕਿੰਟ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਦਰ ਫਿੱਟ ਕਰਕੇ (UQ2 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ) ਅਤੇ ਹਰੇਕ UQ2 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਤਿੰਨੋਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀਆਂ ਦਰਾਂ ਦੀ ਔਸਤ ਲਗਾ ਕੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਬੰਧਿਤ ਵਿਨਾਸ਼ ਗੁਣਾਂਕ ਦੁਆਰਾ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ RC-LH1 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਰ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸਨੂੰ Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) ਵਿੱਚ ਪਲਾਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਸਪੱਸ਼ਟ Km ਅਤੇ Kcat ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ Michaelis-Menten ਮਾਡਲ ਵਿੱਚ ਫਿੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਅਸਥਾਈ ਸੋਖਣ ਮਾਪਾਂ ਲਈ, RC-LH1 ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ IMAC ਬਫਰ ਵਿੱਚ ~2μM ਤੱਕ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 50 mM ਸੋਡੀਅਮ ਐਸਕੋਰਬੇਟ (Merck, USA) ਅਤੇ 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) ਸੀ। ਐਸਕੋਰਬਿਕ ਐਸਿਡ ਨੂੰ ਇੱਕ ਬਲੀਦਾਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਦਾਨੀ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ tert-butaclofen ਨੂੰ ਇੱਕ QB ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਮੁੱਖ RC ਡੋਨਰ ਮਾਪ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਘੱਟ (ਭਾਵ, ਫੋਟੋਆਕਸੀਡਾਈਜ਼ਡ ਨਹੀਂ) ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ। ਲਗਭਗ 3 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਨਮੂਨਾ ਇੱਕ ਕਸਟਮ ਰੋਟੇਟਿੰਗ ਸੈੱਲ (ਲਗਭਗ 0.1 ਮੀਟਰ ਵਿਆਸ, 350 RPM) ਵਿੱਚ 2 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਗ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਲੇਜ਼ਰ ਮਾਰਗ ਵਿੱਚ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਉਤੇਜਨਾ ਦਾਲਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਹਨੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਸਮਾਂ ਹੈ। 1 kHz (NIR ਲਈ 20 nJ ਜਾਂ Vis ਲਈ 100 nJ) ਦੀ ਦੁਹਰਾਓ ਦਰ 'ਤੇ 880 nm 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਲਈ Ti: Sapphire ਲੇਜ਼ਰ ਸਿਸਟਮ (Spectra Physics, USA) ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ~100-fs ਲੇਜ਼ਰ ਪਲਸਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਡਾਟਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਉਤੇਜਨਾ ਵਾਲੀ ਰੌਸ਼ਨੀ ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ। ਐਕਸਪੋਜਰ QA ਨੂੰ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰੇਗਾ (ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਵਾਰ QA ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ)। ਪਰ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਧਿਆਨ ਦਿਓ ਕਿ ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਉਲਟਾਉਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਹਨੇਰੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, RC ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ QA ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਵਾਪਸ ਆ ਜਾਵੇਗਾ। -10 ਤੋਂ 7000 ps ਦੇ ਦੇਰੀ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਅਸਥਾਈ ਸਪੈਕਟਰਾ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਇੱਕ Helios ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (Ultrafast Systems, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਡੇਟਾ ਸੈੱਟਾਂ ਨੂੰ ਅਣ-ਸਮੂਹਕ ਬਣਾਉਣ, ਫਿਰ ਮਿਲਾਉਣ ਅਤੇ ਮਾਨਕੀਕਰਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸਰਫੇਸ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (Ultrafast Systems, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਸੜਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਡਿਫਰੈਂਸ਼ੀਅਲ ਸਪੈਕਟਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਸੰਯੁਕਤ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਰਪੇਟਵਿਊ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ (ਲਾਈਟ ਕਨਵਰਜ਼ਨ ਲਿਮਟਿਡ, ਲਿਥੁਆਨੀਆ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ ਜੋ ਮੂਲ (OriginLab, USA) ਵਿੱਚ ਸਿੰਗਲ-ਵੇਵਲੈਂਥ ਸਪੈਕਟ੍ਰਲ ਈਵੇਲੂਸ਼ਨ ਨੂੰ ਫਿੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਯੰਤਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਨਾਲ ਕਈ ਐਕਸਪੋਨੈਂਟਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (53), ਇੱਕ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਾਲੀ ਫਿਲਮ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ RC ਅਤੇ ਪੈਰੀਫਿਰਲ LH2 ਐਂਟੀਨਾ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਸੀ। ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 20 mM ਟ੍ਰਿਸ (pH 8.0) ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਿਰ 2 mm ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਗ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਕੁਆਰਟਜ਼ ਕਿਊਵੇਟ ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। -10 ਤੋਂ 7000 ps ਦੇ ਦੇਰੀ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ 540 nm 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ 30nJ ਲੇਜ਼ਰ ਪਲਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। Rps. pal ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕਰੋ।
ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 150,000 RCF 'ਤੇ 4°C 'ਤੇ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਪੈਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ 880 nm 'ਤੇ ਇਸਦੀ ਸੋਖਣ ਸ਼ਕਤੀ ਨੂੰ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ਅਤੇ 200 mM NaCl ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 4°C 'ਤੇ ਹਨੇਰੇ ਵਿੱਚ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ 2% (w/v) β-DDM ਵਿੱਚ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਹਿਲਾ ਕੇ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਘੋਲ ਦਿਓ। ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 100 mM ਟ੍ਰਾਈਥਾਈਲ ਅਮੋਨੀਅਮ ਕਾਰਬੋਨੇਟ (pH 8.0) (TEAB; ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਵਿੱਚ 2.5 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ml-1 (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ) ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੱਕ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅੱਗੇ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਵਿਧੀ (54) ਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਿਸਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ 50 μg ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕੁੱਲ 50 μl TEAB ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 1% (w/v) ਸੋਡੀਅਮ ਲੌਰੇਟ (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਸੀ। 60 ਸਕਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸੋਨਿਕੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ 5 ਐਮਐਮ ਟ੍ਰਿਸ (2-ਕਾਰਬੋਕਸਾਈਥਾਈਲ) ਫਾਸਫਾਈਨ (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਨਾਲ 37°C 'ਤੇ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਸ-ਐਲਕਾਈਲੇਸ਼ਨ ਲਈ, ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 10 ਐਮਐਮ ਮਿਥਾਈਲ ਐਸ-ਮਿਥਾਈਲਥਿਓਮੇਥੇਨਸੁਲਫੋਨੇਟ (ਮਰਕ, ਯੂਕੇ) ਨਾਲ ਇਨਕੁਬੇਟ ਕਰੋ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ 200 ਐਮਐਮ ਆਈਸੋਪ੍ਰੋਪਾਨੋਲ ਸਟਾਕ ਘੋਲ ਤੋਂ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ। ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਪਾਚਨ 2 μg ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ/ਐਂਡੋਪ੍ਰੋਟੀਨੇਜ਼ ਲਾਈਸ-ਸੀ ਮਿਸ਼ਰਣ (ਪ੍ਰੋਮੇਗਾ ਯੂਕੇ) ਜੋੜ ਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 37°C 'ਤੇ 3 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਇਨਕੁਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਲੌਰੇਟ ਸਰਫੈਕਟੈਂਟ ਨੂੰ 50 μl ਈਥਾਈਲ ਐਸੀਟੇਟ ਅਤੇ 10 μl 10% (v/v) LC ਗ੍ਰੇਡ ਟ੍ਰਾਈਫਲੂਰੋਐਸੇਟਿਕ ਐਸਿਡ (TFA; ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂਕੇ) ਜੋੜ ਕੇ ਅਤੇ 60 ਸਕਿੰਟਾਂ ਲਈ ਵੌਰਟੈਕਸਿੰਗ ਕਰਕੇ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੜਾਅ ਵੱਖ ਕਰਨ ਨੂੰ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 15,700 ਆਰਸੀਐਫ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਇੱਕ C18 ਸਪਿਨ ਕਾਲਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂਕੇ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੇਪਟਾਈਡ ਵਾਲੇ ਹੇਠਲੇ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਐਸਪੀਰੇਟ ਅਤੇ ਡੀਸਾਲਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਵੈਕਿਊਮ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਸੁਕਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 0.5% TFA ਅਤੇ 3% ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ 500 ng ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੈਨੋਫਲੋ RP ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਸਿਸਟਮ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
Rps. palustris proteome ਡੇਟਾਬੇਸ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਲਈ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਮਿਕਸ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਡੇਟਾਸੈਟ ਪਛਾਣਕਰਤਾ PXD020402 ਦੇ ਤਹਿਤ PRIDE ਪਾਰਟਨਰ ਰਿਪੋਜ਼ਟਰੀ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ਰਾਹੀਂ ProteomeXchange ਅਲਾਇੰਸ ਵਿੱਚ ਜਮ੍ਹਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
RPLC ਦੁਆਰਾ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, RC-LH1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਨੂੰ ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ Rps ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਵਿਧੀ (16) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਪੈਲਸਟ੍ਰਿਸ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਈ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ਅਤੇ 0.03% (w/v) β- (ਬਾਇਓ-ਰੈੱਡ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ) ) DDM ਵਿੱਚ 2 mg ml-1 ਸੀ। ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਵਰਖਾ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ 10 μg ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੱਢਣ ਲਈ 2D ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਕਿੱਟ (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ, USA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਅਤੇ 20 μl 60% (v / v) ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (FA), 20% (v / v) ਐਸੀਟੋਨਿਟ੍ਰਾਈਲ ਅਤੇ 20% (v / v) ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਪੂਰਵ-ਘੋਲਨ ਕਰੋ। RPLC (Dionex RSLC) ਦੁਆਰਾ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (ਮੈਕਸਿਸ UHR-TOF, ਬਰੂਕਰ) ਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਪੰਜ ਮਾਈਕ੍ਰੋਲੀਟਰਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। 90%(v/v) ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ TFA ਵਿੱਚ 85%(v/v) ਘੋਲਕ A [0.1%(v/v) FA ਅਤੇ 0.02%(V/v) ਜਲਮਈ ਘੋਲ] ਤੋਂ 85%(v/v) ਘੋਲਕ B [0.1%(v/v) FA ਅਤੇ 0.02%(v/v) ਦੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਦੇ ਨਾਲ 60°C ਅਤੇ 100μlmin -1 'ਤੇ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ MabPac 1.2×100 mm ਕਾਲਮ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂਕੇ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਸਟੈਂਡਰਡ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਓਨਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਸਰੋਤ ਅਤੇ ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 60 ਮਿੰਟਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਮੇਂ ਲਈ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ 100 ਤੋਂ 2750 m/z (ਮਾਸ-ਟੂ-ਚਾਰਜ ਅਨੁਪਾਤ) ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ExPASy ਬਾਇਓਇਨਫਾਰਮੈਟਿਕਸ ਰਿਸੋਰਸ ਪੋਰਟਲ FindPept ਟੂਲ (https://web.expasy.org/findpept/) ਦੀ ਮਦਦ ਨਾਲ, ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੂੰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੇ ਸਬਯੂਨਿਟਾਂ ਨਾਲ ਮੈਪ ਕਰੋ।
ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 100 ਮਿਲੀਲੀਟਰ NF-ਘੱਟ (10μMm-2 s-1), ਦਰਮਿਆਨੇ (30μMm-2 s-1) ਜਾਂ ਉੱਚ (300μMm-2 s-1) ਰੌਸ਼ਨੀ ਵਿੱਚ 72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ। M22 ਦਰਮਿਆਨੇ (M22 ਦਰਮਿਆਨੇ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਮੋਨੀਅਮ ਸਲਫੇਟ ਨੂੰ ਛੱਡ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸੋਡੀਅਮ ਸੁਕਸੀਨੇਟ ਨੂੰ ਸੋਡੀਅਮ ਐਸੀਟੇਟ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਇੱਕ 100 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਸਕ੍ਰੂ-ਟੌਪ ਬੋਤਲ (23) ਵਿੱਚ। ਪੰਜ 30-ਸਕਿੰਟ ਦੇ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਲਾਈਸ ਕਰਨ ਲਈ 0.1 ਮਾਈਕ੍ਰੋਨ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕੇ 1:1 ਦੇ ਵਾਲੀਅਮ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਮਣਕੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਠੰਢਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪਦਾਰਥ, ਅਟੁੱਟ ਸੈੱਲਾਂ ਅਤੇ ਕੱਚ ਦੇ ਮਣਕਿਆਂ ਨੂੰ ਬੈਂਚਟੌਪ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਵਿੱਚ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 16,000 RCF 'ਤੇ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ Ti 70.1 ਰੋਟਰ ਵਿੱਚ 100,000 RCF ਦੇ ਨਾਲ 20 mM ਟ੍ਰਿਸ-HCl (pH 8.0) ਵਿੱਚ 40/15% (w/w) ਸੁਕਰੋਜ਼ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਦੇ ਨਾਲ 10 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਾਡੇ ਪਿਛਲੇ ਕੰਮ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, PufW (16) 'ਤੇ His ਟੈਗ ਦਾ ਇਮਯੂਨੋਡਿਟੈਕਸ਼ਨ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, 2x SDS ਲੋਡਿੰਗ ਬਫਰ (Merck, UK) ਵਿੱਚ ਦੋ ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸ਼ੁੱਧ ਕੋਰ ਕੰਪਲੈਕਸ (11.8 nM) ਜਾਂ RC ਦੀ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ (ਘਟੇ ਹੋਏ ਅੰਤਰ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਅਤੇ ਰੰਗੇ ਹੋਏ ਜੈੱਲ 'ਤੇ ਲੋਡ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਆਕਸੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ)। ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ 12% ਬਿਸ-ਟ੍ਰਿਸ ਨੂਪੇਜ ਜੈੱਲ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂਕੇ) 'ਤੇ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। RC-L ਸਬਯੂਨਿਟ ਨੂੰ ਲੋਡ ਕਰਨ ਅਤੇ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਜੈੱਲ ਨੂੰ ਕੂਮਾਸੀ ਬ੍ਰਿਲਿਅੰਟ ਬਲੂ (ਬਾਇਓ-ਰੈਡ, ਯੂਕੇ) ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਦੂਜੇ ਜੈੱਲ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਇਮਯੂਨੋਐਸੇ ਲਈ ਮੀਥੇਨੌਲ-ਐਕਟੀਵੇਟਿਡ ਪੌਲੀਵਿਨਾਇਲਾਈਡੀਨ ਫਲੋਰਾਈਡ (PVDF) ਝਿੱਲੀ (ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ, ਯੂਕੇ) ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। PVDF ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 ਅਤੇ 5% (w / v) ਸਕਿਮਡ ਦੁੱਧ ਪਾਊਡਰ ਵਿੱਚ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਐਂਟੀ-ਹਿਸ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਫਰ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਕਰੋ [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ਅਤੇ 0.05% (v / v) Tween-20] ਵਿੱਚ 1:1000 A190-114A, ਬੇਥਾਈਲ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼, USA) ਵਿੱਚ 4 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 3 ਵਾਰ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਹਾਰਸਰੇਡਿਸ਼ ਪੇਰੋਕਸੀਡੇਸ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ, ਯੂਕੇ) ਐਂਟੀ-ਮਾਊਸ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 1:10,000 ਪਤਲਾ) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। WESTAR ETA C 2.0 ਕੈਮੀਲੂਮਿਨਿਸੈਂਸ ਸਬਸਟਰੇਟ (ਸਾਇਨਾਜੇਨ, ਇਟਲੀ) ਅਤੇ ਐਮਰਸ਼ਮ ਇਮੇਜਰ 600 (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ, ਯੂਕੇ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਖੋਜ (ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 3 ਧੋਣ ਤੋਂ 5 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ) ਦੀ ਆਗਿਆ ਦੇਣ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਹਰੇਕ ਸਟੇਨਡ ਜੈੱਲ ਜਾਂ ਇਮਯੂਨੋਐਸੇ ਲੇਨ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਵੰਡ ਨੂੰ ਖਿੱਚ ਕੇ, ਪੀਕ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਕੇ ਅਤੇ RC-L (ਸਟੇਨਡ ਜੈੱਲ) ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W (ਇਮਯੂਨੋਐਸੇ) ਦੇ ਤੀਬਰਤਾ ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਕੇ, ImageJ (57) ਵਿੱਚ ਚਿੱਤਰ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕਰੋ। ਇਹਨਾਂ ਅਨੁਪਾਤਾਂ ਨੂੰ ਇਹ ਮੰਨ ਕੇ ਕਿ ਸ਼ੁੱਧ RC-LH114-W ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ RC-L ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-W ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ 1:1 ਸੀ ਅਤੇ ਉਸ ਅਨੁਸਾਰ ਪੂਰੇ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾ ਕੇ ਮੋਲਰ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇਸ ਲੇਖ ਲਈ ਪੂਰਕ ਸਮੱਗਰੀ ਲਈ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ਵੇਖੋ।
ਇਹ ਇੱਕ ਖੁੱਲ੍ਹਾ ਪਹੁੰਚ ਵਾਲਾ ਲੇਖ ਹੈ ਜੋ ਕਰੀਏਟਿਵ ਕਾਮਨਜ਼ ਐਟ੍ਰਬਿਊਸ਼ਨ ਲਾਇਸੈਂਸ ਦੀਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਧੀਨ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਇਹ ਲੇਖ ਕਿਸੇ ਵੀ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਪਾਬੰਦੀ ਦੇ ਵਰਤੋਂ, ਵੰਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰਜਨਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਬਸ਼ਰਤੇ ਕਿ ਅਸਲ ਕੰਮ ਦਾ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਹਵਾਲਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੋਵੇ।
ਨੋਟ: ਅਸੀਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਆਪਣਾ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਦੇਣ ਲਈ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ ਤਾਂ ਜੋ ਜਿਸ ਵਿਅਕਤੀ ਨੂੰ ਤੁਸੀਂ ਪੰਨੇ 'ਤੇ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹੋ ਉਸਨੂੰ ਪਤਾ ਲੱਗੇ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ ਕਿ ਉਹ ਈਮੇਲ ਦੇਖੇ ਅਤੇ ਇਹ ਸਪੈਮ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਕੋਈ ਵੀ ਈਮੇਲ ਪਤਾ ਕੈਪਚਰ ਨਹੀਂ ਕਰਾਂਗੇ।
ਇਹ ਸਵਾਲ ਇਹ ਜਾਂਚਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਵਿਜ਼ਟਰ ਹੋ ਅਤੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਸਪੈਮ ਸਬਮਿਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ।
ਡੇਵਿਡ ਜੇ.ਕੇ. ਸਵੈਨਸਬਰੀ, ਪਾਰਕ ਕਿਆਨ, ਫਿਲਿਪ ਜੇ. ਜੈਕਸਨ, ਕੈਟਲਿਨ ਐਮ. ਫੈਰੀਸ, ਡੇਰੀਅਸ ਐਮ. ਨੀਡਜ਼ਵਿਡਜ਼ਕੀ, ਐਲਿਜ਼ਾਬੈਥ ਸੀ. ਮਾਰਟਿਨ, ਡੇਵਿਡ ਏ. ਫਾਰਮਰ, ਲੋਰਨਾ ਏ. ਮੈਲੋਨ, ਰੇਬੇਕਾ ਐਫ. ਥੌਮਸਨ, ਨੀਲ ਏ. ਰੈਨਸਨ, ਡੈਨੀਅਲ ਪੀ. ਕੈਨਿਫ, ਮਾਰਕ ਜੇ. ਡਿਕਮੈਨ, ਡੇਵੀ ਹੋਲਟਨ, ਕ੍ਰਿਸਟੀਨ ਕਿਰਮੇਅਰ, ਐਂਡਰਿਊ ਹਿਚਕੌਕ, ਸੀ. ਨੀਲ ਹੰਟਰ
ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਜਾਲ 1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਬਣਤਰ ਕੁਇਨੋਨ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਨਵੀਂ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਡੇਵਿਡ ਜੇ.ਕੇ. ਸਵੈਨਸਬਰੀ, ਪਾਰਕ ਕਿਆਨ, ਫਿਲਿਪ ਜੇ. ਜੈਕਸਨ, ਕੈਟਲਿਨ ਐਮ. ਫੈਰੀਸ, ਡੇਰੀਅਸ ਐਮ. ਨੀਡਜ਼ਵਿਡਜ਼ਕੀ, ਐਲਿਜ਼ਾਬੈਥ ਸੀ. ਮਾਰਟਿਨ, ਡੇਵਿਡ ਏ. ਫਾਰਮਰ, ਲੋਰਨਾ ਏ. ਮੈਲੋਨ, ਰੇਬੇਕਾ ਐਫ. ਥੌਮਸਨ, ਨੀਲ ਏ. ਰੈਨਸਨ, ਡੈਨੀਅਲ ਪੀ. ਕੈਨਿਫ, ਮਾਰਕ ਜੇ. ਡਿਕਮੈਨ, ਡੇਵੀ ਹੋਲਟਨ, ਕ੍ਰਿਸਟੀਨ ਕਿਰਮੇਅਰ, ਐਂਡਰਿਊ ਹਿਚਕੌਕ, ਸੀ. ਨੀਲ ਹੰਟਰ
ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਜਾਲ 1 ਕੰਪਲੈਕਸ ਦੀ ਉੱਚ-ਰੈਜ਼ੋਲੂਸ਼ਨ ਬਣਤਰ ਕੁਇਨੋਨ ਗਤੀਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਨਵੀਂ ਸਮਝ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ।
©2021 ਅਮੈਰੀਕਨ ਐਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਫਾਰ ਦ ਐਡਵਾਂਸਮੈਂਟ ਆਫ਼ ਸਾਇੰਸ। ਸਾਰੇ ਹੱਕ ਰਾਖਵੇਂ ਹਨ. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ਅਤੇ COUNTER ਦਾ ਭਾਈਵਾਲ ਹੈ। ਸਾਇੰਸ ਐਡਵਾਂਸ ISSN 2375-2548।